条件性表达Hoxa7建立具有红系和巨核系双向分化潜能的小鼠造血祖细胞系

研究人员针对骨髓中双潜能巨核-红系祖细胞(MEP)稀缺且缺乏合适实验模型的问题，开展了基于Hoxa7基因调控的造血祖细胞条件性永生化研究。通过构建雌激素调控的Hoxa7融合蛋白(ERHBD-Hoxa7)联合血小板生成素(TPO)，成功建立了可长期扩增的MEP样细胞系(Hoxa7-TPO)。该细胞在Hoxa7失活后可分化为功能成熟的红细胞(RBC)和血小板，并能通过CRISPR/Cas9技术模拟Bernard-Soulier综合征等血液疾病表型，为研究造血分化和疾病建模提供了新工具。

　　

在成人造血过程中，骨髓中的造血干细胞(HSC)经过多级分化最终形成各类血细胞。其中，巨核-红系祖细胞(MEP)作为双向潜能祖细胞，既能分化为负责氧气运输的红细胞(RBC)，又能形成参与止血的血小板。然而，MEP在骨髓中含量稀少且难以体外扩增，这严重制约了对其分化机制和相关疾病的研究。

为解决这一难题，圣犹达儿童研究医院(St. Jude Children's Research Hospital)等机构的研究团队开发了一种创新性方法。他们发现同源盒基因Hoxa7在MEP发育中起关键调控作用——Hoxa7基因缺失会导致小鼠MEP数量减少，而异常激活则与白血病发生相关。基于此，研究人员构建了雌激素受体激素结合域(ERHBD)与Hoxa7的融合蛋白，通过病毒转导联合血小板生成素(TPO)培养，成功建立了可长期扩增的Hoxa7-TPO细胞系。这项突破性研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究主要采用了以下关键技术：1)构建雌激素调控的Hoxa7表达系统(ERHBD-Hoxa7)；2)通过流式细胞术分析细胞表面标志物；3)体外巨核细胞分化及血小板生成实验；4)红细胞体外分化培养体系；5)CRISPR/Cas9基因编辑技术；6)小鼠移植模型评估体内分化潜能；7)转录组测序(RNA-seq)分析；8)血小板功能检测实验。

研究结果部分：

1. Hoxa7-TPO细胞的生成

   研究人员将ERHBD-Hoxa7转导至小鼠骨髓细胞，在雌激素和TPO存在条件下获得了稳定增殖的Hoxa7-TPO细胞系。这些细胞呈现原始母细胞形态，高表达c-kit、CD150和CD105等祖细胞标志物，但缺乏成熟血细胞标记。

2. 体外巨核细胞分化潜能

   撤除雌激素后，Hoxa7-TPO细胞在TPO诱导下可分化为多倍体巨核细胞(MK)，最高可达32N。这些细胞能形成典型的前血小板突起(proplatelet)，且表面标志物CD41和CD42d的表达动态与原发性MK相似。

3. 转录组特征分析

   RNA-seq显示未分化Hoxa7-TPO细胞的基因表达谱与原发性MEP高度相似。分化后，巨核细胞特异性基因(Pf4、Vwf等)显著上调，而细胞周期相关基因下调。

4. 体内分化潜能

   将Hoxa7-TPO细胞移植至致死量照射的小鼠后，在外周血中检测到功能性GFP⁺血小板和红细胞。血小板具有正常的激活(CD62P上调)和聚集功能，并能参与血管损伤处的血栓形成。

5. 体外红系分化

   在促红细胞生成素(EPO)存在下，Hoxa7-TPO细胞可分化为血红蛋白化的红细胞，经历核浓缩和去核等典型过程。

6. 基因编辑应用

   通过CRISPR/Cas9敲除关键转录因子Klf1或Nfe2，分别重现了红细胞生成障碍和血小板减少的表型；敲除Gp1ba则模拟了Bernard-Soulier综合征的血小板形态异常。

这项研究建立了首个可长期扩增且保持双系分化潜能的MEP样细胞系，解决了该领域长期存在的模型稀缺问题。Hoxa7-TPO细胞不仅能用于解析MEP向红系和巨核系分化的调控机制，还可通过基因编辑快速模拟血液疾病，为药物筛选和细胞治疗研究提供了重要平台。特别值得注意的是，该细胞系在液氮中冻存4年后仍保持稳定性能，具有显著的实用价值。研究揭示的Hoxa7在维持MEP自我更新中的作用，也为理解造血发育和白血病发生提供了新视角。