基于磷酸硫酯与磺酰胺DNA分子内交叉激活的化学自连接技术及其在基因工程中的应用

日本研究人员开发了一种无需外源试剂的DNA自连接新策略，通过3'-磷酸硫酯(PS)与5'-二硝基苯磺酰胺(DNBSA)在模板DNA上的分子内交叉激活，在近生理条件下高效形成P3'→N5'磷酰胺键连接（产率>80%）。该技术解决了传统化学连接依赖外部激活剂、中间体不稳定的难题，为基因组工程和DNA纳米技术提供了新型工具。

　　

在基因组工程和DNA纳米技术领域，长链DNA构建体的高效组装一直是关键挑战。传统化学连接方法依赖外源激活剂，且活性中间体易水解，限制了其在生物环境中的应用。针对这一瓶颈，日本东京大学（The University of Tokyo）的研究团队在《Communications Chemistry》发表创新成果，开发出基于分子内交叉激活的DNA自连接技术。

研究团队通过合成5'-DNBSA修饰的DNA片段，与3'-PS DNA在模板链引导下发生自主反应。关键技术包括：(1)设计稳定的5'-DNBSA胸苷磷酰胺单体合成路线；(2)优化温和脱保护条件保持DNBSA基团完整性；(3)建立pH8缓冲体系中分子内激活反应体系；(4)通过荧光标记和dPAGE分析定量连接效率。

5'-DNBSA DNA的合成与稳定性

通过五步反应合成5'-DNBSA胸苷磷酰胺单体（总产率13%），31P NMR证实其-30°C下可稳定储存1个月。采用28%氨水室温处理2小时的温和条件，实现固相合成后DNBSA基团保留率达85%（图2）。

连接反应条件优化

在pH8、37°C条件下，20μM浓度DNA经预退火处理后，48小时连接效率达84%（图3,4）。LC-MS检测到硫酯中间体，证实反应按分步机制进行（图4B）。对比实验显示，无模板DNA时即使100μM浓度也无连接产物（图S6），证明反应严格依赖模板指导的空间邻近效应。

长链DNA与生物兼容性验证

该技术成功连接67nt 3'-PS DNA与46nt 5'-DNBSA DNA（产率63%）。在10mM谷胱甘肽(GSH)存在下仍保持25%连接效率（图S3），显示一定程度的生物环境耐受性，但需进一步优化以提高细胞内适用性。

这项研究开创性地利用DNBSA基团的分子内激活特性，实现了PS-DNA的高效自连接。相比传统方法，其优势在于：(1)无需外源试剂，反应条件温和（pH8,37°C）；(2)DNBSA修饰DNA具有优异水稳定性；(3)原位生成活性中间体避免水解。该技术为基因合成、DNA纳米结构构建及分子诊断提供了新工具，特别适用于需要避免外源试剂的生物体系应用。未来通过优化反应动力学和核酶抗性，有望推动该技术在活细胞内的基因编辑应用。