四翅滨藜TRV病毒诱导基因沉默体系的建立与优化：一种克服遗传转化技术瓶颈的反向遗传学平台

本研究针对盐生模式植物四翅滨藜（Atriplex canescens）缺乏稳定遗传转化体系的技术难题，成功构建了基于烟草脆裂病毒（TRV）的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统。通过靶向八氢番茄红素脱氢酶基因（AcPDS）和水通道蛋白基因（AcTIP2;1/AcPIP2;5），采用真空辅助农杆菌浸润法（0.5 kPa, 10 min）使沉默效率达16.4%，为解析该物种抗逆机制提供了高效反向遗传学工具。

　　

在植物抗逆机制研究中，盐生植物四翅滨藜（Atriplex canescens）因其卓越的耐盐碱特性被视为重要的基因资源库。然而这个"沙漠勇士"长期面临着一个尴尬处境——缺乏可靠的遗传转化体系，使得其宝贵的抗逆基因功能研究陷入"有基因无验证"的困境。传统转基因技术在该物种中遭遇转化效率低、嵌合体多等瓶颈，而新兴的CRISPR/Cas9技术同样受制于遗传转化难题。这种技术壁垒严重阻碍了从该物种中挖掘抗逆基因用于作物改良的进程。

来自甘肃省某研究机构的研究人员另辟蹊径，选择病毒诱导基因沉默（VIGS）这条技术路径展开攻关。这种不依赖稳定遗传转化的反向遗传学策略，通过病毒载体瞬时抑制目标基因表达，特别适合难以转化的非模式植物。研究人员以八氢番茄红素脱氢酶基因（AcPDS）为报告基因，当这个参与类胡萝卜素合成的关键基因被沉默时，植物会出现特征性光漂白表型，成为直观的沉默效率指示器。相关研究成果发表在《Plant Methods》期刊。

研究团队运用三项核心技术：首先采用巢式PCR从四翅滨藜转录组数据中克隆AcPDS全长序列；其次利用SGN-VIGS在线工具预测高效沉默靶片段，构建TRV2:AcPDS重组载体；最后通过比较种子浸泡与真空辅助农杆菌浸润（OD₆₀₀=0.8）两种接种方法，建立最优转化体系。实验材料选用甘肃民勤县（北纬38°37′，东经103°5′）采集的四翅滨藜种子，经50%硫酸处理8小时破除休眠。

AcPDS基因的克隆与载体构建

系统发育分析显示四翅滨藜AcPDS与藜麦CqPDS相似度高达96.3%，属于同一进化分支。研究人员设计了三段保守区域（AcPDS₃₁₁、AcPDS₇₅₁、AcPDS₁₂₂₁）插入TRV2载体，形成三种重组沉默载体。

不同接种方法的沉默效率比较

传统种子浸泡法仅使AcPDS表达量降低30%，而真空辅助农杆菌浸润（0.5 kPa, 10 min）显著提升效率：完全白化叶片中AcPDS转录本减少65-80%，黄绿色叶片降低40-58%。其中TRV2:AcPDS₃₁₁构建体沉默效率最高（21.1%），伴随叶绿素a含量下降35-47%。

接种材料的优化探索

与常规认知相反，去除种皮并未提高沉默效率（14.7%），反而导致30%的幼苗死亡率。这表明四翅滨藜萌发种子（胚根长1-3 cm）是最佳接种材料，其完整种皮不妨碍农杆菌侵染。

系统适用性验证

在水通道蛋白基因AcTIP2;1和AcPIP2;5的沉默实验中，GFP荧光筛选显示转录本分别减少60.3%和69.5%，证实该系统适用于不同类型基因的功能研究。

这项研究建立的VIGS-TRV系统成功突破了四翅滨藜遗传转化的技术壁垒。虽然16.4%的平均沉默效率看似不高，但考虑到该物种固有的抗病毒机制，这一成果已属重大突破。特别值得注意的是，真空辅助农杆菌浸润法的建立为其他难转化植物提供了技术范本。该系统不仅可用于快速验证转录组筛选的抗逆候选基因，其模块化载体设计还可兼容CRISPR/Cas9元件，为后续基因编辑研究奠定基础。正如研究者所言，这项成果"为盐生植物功能基因组学研究打开了新的大门"，对开发利用野生植物抗逆基因资源具有重要战略意义。