重组腺相关病毒生产过程中非编码小RNA动态调控机制的揭示及其在基因治疗中的应用意义

这篇综述深入探讨了重组腺相关病毒(rAAV)生产过程中微小RNA(miRNA)和小核仁RNA(snoRNA)的动态表达谱及其调控机制。研究通过HEK293F细胞模型，发现142个差异表达miRNA中128个与"病毒过程"相关，揭示了这些非编码RNA通过调控核质运输、先天免疫、凋亡等通路影响rAAV生产的关键作用，为优化基因治疗载体生产提供了新视角。

　　

引言

重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗的关键载体，其生产过程中宿主细胞的分子响应机制尚未完全阐明。近年研究发现，非编码RNA(ncRNA)尤其是微小RNA(miRNA)和小核仁RNA(snoRNA)在病毒与宿主互作中扮演重要角色。本研究通过时间序列分析，首次系统揭示了HEK293F细胞在rAAV生产过程中ncRNA的动态调控网络。

材料与方法

实验采用三质粒转染系统，在悬浮培养的HEK293F细胞中生产携带SEAP报告基因的rAAV2载体。通过微阵列技术监测0-72小时生产周期内miRNA和snoRNA的表达变化，结合生物信息学分析预测靶基因功能。差异表达阈值设定为fold change≥1.5且p<0.05，采用DPGP混合模型进行时间序列聚类。

结果

细胞参数与病毒滴度

rAAV转染导致细胞生长减缓，48小时出现病毒生产峰值(3.9×10¹⁰ vg/mL)。差异表达分析发现：

• miRNA动态：142个核心miRNA在24-72小时生产高峰期显著变化，形成4类表达模式：持续下降型(如靶向核孔蛋白NUPs的miR-17-5p)、病毒滴度同步型(如调控泛素化的miR-1273h-5p)、持续上升型(如抑制凋亡的miR-4299)和晚期激活型(如调控病毒转录的miR-1207-5p)。

• 功能富集：128个miRNA显著富集于"病毒过程"GO term，靶向干扰素通路关键因子(STAT1、MAVS等)和DNA损伤响应蛋白(PML、MRE11)。

• snoRNA特征：5个snoRNA(SNORD38B、SCARNA2等)呈现生产相关表达，其中SCARNA2可能通过调控剪接体影响rAAV基因组加工。

讨论

研究发现miRNA通过多层面调控优化病毒生产环境：早期下调先天免疫应答(如Jak/STAT通路)和促进核输入；中期抑制凋亡和激活泛素化系统；晚期调控转录因子(如SP1)促进病毒基因表达。snoRNA则可能通过修饰核糖体RNA影响病毒蛋白翻译效率。这些发现为通过工程化宿主细胞ncRNA网络提升rAAV产量提供了新策略，例如靶向miR-23b-5p可缓解干扰素抑制效应，而调控SNORD38B或能优化病毒组装。

结论

该研究首次绘制了rAAV生产过程中ncRNA的动态图谱，揭示了miRNA-snoRNA调控网络在平衡宿主防御与病毒复制中的核心作用，为发展下一代高产rAAV制造平台奠定了分子基础。未来研究可针对关键ncRNA开展基因编辑，验证其对病毒载体生产的精确调控能力。