基于qPCR与dPCR技术的CRISPR/Cas9诱导甘蓝原生质体突变检测方法开发与比较研究

这篇研究通过实时定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）技术，建立了CRISPR/Cas9编辑的甘蓝原生质体突变检测体系。研究证实dPCR在低频率突变（4.5%-26.4%）检测中灵敏度显著优于qPCR（检出率100% vs 80%），且与二代测序（NGS）结果高度一致。两种方法为植物基因编辑研究提供了高效、低成本的技术选择，尤其适用于原生质体等混合样本的早期编辑效率评估。

　　

1 引言

基因组编辑技术正通过精准修饰遗传物质改变农业育种格局。CRISPR/Cas9系统凭借其简单高效的特点，成为最广泛应用的基因编辑工具。该系统通过向导RNA（gRNA）引导Cas9核酸酶在靶位点产生双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）机制修复。在真核细胞中，NHEJ是主要修复途径，常导致小片段插入或缺失（indel）。

原生质体瞬时转化技术因其可直接摄取CRISPR试剂、快速表达构建体等优势，成为基因组编辑构建体快速测试的重要工具。然而，如何高效检测混合群体中的低频编辑事件仍是挑战。传统方法如PCR-RFLP、T7E1检测灵敏度有限，而克隆测序又过于繁琐。本研究首次将qPCR和dPCR技术应用于编辑原生质体的突变检测。

2 材料与方法

实验采用靶向甘蓝基因的pHSN401载体转化原生质体样本，编辑效率经NGS确认为4.50%-26.0%。设计特异性TaqMan MGB探针：FAM标记探针覆盖基因PAM区域，Yakima Yellow标记探针靶向参考基因。通过优化引物探针浓度和扩增条件，建立双重复合检测体系。

qPCR采用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix，通过2^-ΔΔCt法计算相对扩增量。dPCR使用QIAcuity ONE系统，通过FAM/YY阳性分区比计算编辑效率。所有样本均设3次技术重复，并与NGS结果比对。

3 结果

3.1 qPCR条件优化

初始双重复合反应中基因扩增效率仅65.3%。通过调整引物探针组合（Mix 4）和改用短扩增子引物（PDS-F2/R2），使和扩增效率分别提升至94.5%和93.2%。

3.2 qPCR检测效能

在编辑效率≥10.1%的样本中，qPCR成功检出突变（相对扩增值0.55-0.94），但对<10%突变样本存在假阴性。三份低效样本（4.9%-10.0%）相对扩增值>1.0，被误判为未编辑。

3.3 dPCR检测优势

dPCR在1-10 ng DNA投入量下均保持稳定检测（RSD≤10%）。所有测试样本（包括4.5%低效样本）均成功检出，FAM/YY分区比与NGS编辑效率显著相关（平均绝对误差3.92%）。典型样本中，16.9%编辑效率对应0.82分区比，4.9%效率对应0.95分区比。

4 讨论

研究首次证实dPCR在原生质体编辑检测中的超敏优势，其绝对定量特性克服了qPCR对低丰度突变（<10%）的漏检问题。值得注意的是，本研究中主要突变类型为1 bp插入（占85%），这类小变异对探针结合的干扰较小，可能是dPCR保持高灵敏度的关键因素。

两种技术各有适用场景：qPCR适合大规模初筛，成本较低且通量高；dPCR则适用于需要精确定量的关键实验，如编辑体系优化或低频突变验证。未来可进一步探索：①延长探针覆盖区域以提高对大片段突变的检测率；②开发多重检测体系同步监控多个靶点。

该研究为植物基因编辑研究提供了标准化检测方案，特别是为原生质体、悬浮细胞等瞬时转化系统的快速评估建立了技术规范，将显著加速作物育种中CRISPR技术的应用进程。