源自自发性高血压大鼠血管外膜成纤维细胞的Exomeres通过传递骨桥蛋白(OPN)促进血管重塑的机制研究

这篇研究揭示了自发性高血压大鼠(SHR)血管外膜成纤维细胞(VAFs)分泌的纳米颗粒exomeres(EMs)通过传递骨桥蛋白(OPN)，激活整合素αVβ3/FAK/PI3K/AKT信号通路，促进血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖迁移和血管重塑。该发现为高血压血管病变提供了新的干预靶点。

　　

1 引言

细胞间通讯通过细胞外囊泡(EVs)和非囊泡纳米颗粒(NVEPs)实现。近年发现的exomeres(EMs)和supermeres(SMs)作为新型细胞间信使，在心血管疾病中发挥重要作用。血管外膜成纤维细胞(VAFs)作为血管外膜主要细胞，通过旁分泌机制调控血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化。前期研究发现自发性高血压大鼠(SHR)的VAFs分泌的小细胞外囊泡(sEVs)促进血管重塑，但EMs/SMs的作用尚不明确。

2 结果

2.1 VAFs来源sEVs、EMs和SMs的特征

通过超速离心法从WKY和SHR大鼠主动脉VAFs培养基中分离出sEVs、EMs和SMs。原子力显微镜(AFM)和透射电镜(TEM)显示三者形态差异：sEVs(30-100nm)具有脂双层膜结构，EMs(28-50nm)和SMs(22-32nm)无膜结构。蛋白质组分析发现CD9、TSG101和PCSK9特异性表达于sEVs，pro-PCSK9、OPN和RISC仅存在于EMs，AGO2富集于SMs。

2.2 EMs和SMs对VSMCs增殖迁移的影响

SHR来源EMs(S-EMs)以浓度依赖方式促进WKY和SHR的VSMCs增殖，40μg/mL浓度作用48小时达最大效应。划痕实验和Transwell实验证实S-EMs显著增强VSMCs迁移能力，并增加F-actin微丝数量。而WKY来源EMs(W-EMs)及两组的SMs均无此效应。

2.3 EMs的细胞摄取机制

荧光标记显示S-EMs通过多种途径被VSMCs内化。内吞抑制剂bafilomycin A1(液泡型H⁺-ATP酶抑制剂)抑制作用最强，其次是dynasore(发动蛋白抑制剂)、cytochalasin D(G-actin结合剂)和CK-666(Arp2/3复合物抑制剂)。这些抑制剂均能减弱S-EMs促增殖迁移作用。

2.4 EMs蛋白质组学分析

质谱鉴定发现S-EMs中骨桥蛋白(OPN)和丝氨酸羧肽酶1(RISC)表达显著高于W-EMs。Western blot验证OPN和RISC特异性富集于EMs，而sEVs和SMs中几乎不表达。

2.5 OPN在EMs功能中的关键作用

慢病毒shRNA敲减VAFs的OPN后，其分泌的EMs丧失促VSMCs增殖迁移能力；而RISC敲减不影响EMs功能。OPN抗体处理也可阻断S-EMs效应。提示EMs通过传递OPN而非RISC发挥作用。

2.6 整合素αVβ3介导OPN功能

蛋白互作预测显示OPN与整合素αVβ3和CD44存在结合。单细胞测序数据证实人主动脉VSMCs高表达整合素αVβ3和CD44。分子对接和表面等离子共振(SPR)实验证实OPN与整合素αVβ3直接结合。功能实验显示整合素αVβ3抑制剂Cyclo(-RGDfK)完全阻断S-EMs效应，而CD44敲减无影响。

2.7 整合素αVβ3/FAK/PI3K/AKT信号通路激活

S-EMs显著提高VSMCs中FAK(Tyr397)、PI3K(p85α)和AKT(Ser473)磷酸化水平。整合素αVβ3抑制剂或FAK(Y15)、PI3K(LY294002)、AKT(AKTi1/2)特异性抑制剂均可阻断S-EMs效应。

2.8 颈动脉局部OPN敲减轻血管重塑

腺相关病毒(AAV)介导的颈动脉局部OPN敲减显著改善SHR血管重塑，降低PI3K/AKT磷酸化，但不影响血压。提示血管OPN升高是SHR血管重塑的关键因素。

2.9 EMs的系统性效应

静脉注射S-EMs(200μg/次，10次)3周后，WKY和SHR均出现血压升高和血管重塑。生物分布检测显示S-EMs在动脉、肾脏和肝脏富集。急性注射实验表明其升压效应非直接激活交感神经所致。

3 讨论

本研究首次揭示VAFs来源EMs通过OPN-整合素αVβ3/FAK/PI3K/AKT轴促进高血压血管重塑的新机制。与sEVs不同，EMs具有独特的蛋白质组成和功能特征。血管局部OPN干预可能成为高血压血管病变治疗新策略。

4 材料与方法

实验采用8周龄雄性WKY和SHR，原代分离培养VAFs和VSMCs。通过超速离心分离纳米颗粒，AFM/TEM表征形态，CCK-8/EdU检测增殖，划痕/Transwell分析迁移。采用shRNA基因沉默、Co-IP/SPR验证蛋白互作，AAV局部基因干预等技术。数据采用双盲法分析，组间比较采用双因素ANOVA检验。