癌症细胞系来源的细胞外囊泡制备中穹窿颗粒的评估

这篇研究通过差异离心(DC)、尺寸排阻色谱(SEC)和免疫磁珠捕获技术，系统评估了口腔癌细胞系分泌的细胞外囊泡(EV)中穹窿颗粒(vault particles)的污染情况。研究证实穹窿RNA(vtRNA)和主要穹窿蛋白(MVP)在EV制剂中高丰度存在，但通过蛋白酶/RNA酶保护实验和冷冻电镜(cryo-TEM)证实其并非真正的EV cargo，而是共沉淀污染物。创新性地采用CD9/CD63/CD81三标记免疫捕获策略，首次实现了无穹窿污染的EV纯化，为EV研究提供了关键方法学参考。

　　

穹窿颗粒在EV制备中的污染现状

研究聚焦口腔鳞癌细胞系(H357/SCC4)分泌的细胞外囊泡(EV)，发现通过常规差异离心(DC)获得的10万g超离(100k)沉淀中，穹窿颗粒组分异常丰富。qPCR显示vtRNA1-1/1-2/1-3三种亚型在100k沉淀中含量最高，其中vtRNA1-1占比超60%。Western blot检测到穹窿颗粒三大蛋白组分——主要穹窿蛋白(MVP)、端粒酶蛋白1(TEP1)和多聚ADP核糖聚合酶4(PARP4)的共沉淀现象。

拓扑学验证揭示污染本质

通过创新性设计蛋白酶K/RNA酶A保护实验，发现100k沉淀中90%的MVP可被直接蛋白酶降解，而典型EV内腔标志物TSG101需经Triton X-100膜破坏后才被降解。RNase处理实验显示，预先蛋白酶消化会使vtRNA1-1丰度显著降低2个Ct值，证实其保护依赖蛋白外壳而非脂质膜。冷冻电镜直接观测到尺寸41.6×85.2 nm的桶状穹窿结构，与EV无物理关联。

不同分离技术的比较研究

尺寸排阻色谱(SEC)分离显示，穹窿蛋白与EV标志物(CD63/CD9/TSG101)在7-9号洗脱峰共出现。纳米流式检测发现SEC制品中14.3%为非膜结构颗粒，100k沉淀中该比例为5.1%。而免疫捕获技术展现突破性优势：当直接处理条件培养基时，CD9/CD63/CD81三标记磁珠可特异性捕获EV，使MVP完全保留在未结合组分；但若先超离再捕获，则因颗粒聚集导致分离失败。

方法学创新与临床意义

该研究首次建立"条件培养基→直接免疫捕获→磁珠分离"的无穹窿EV纯化流程。实验证实传统DC法会使直径40 nm的穹窿颗粒与小型EV(sEV)共沉淀，而SEC虽能保持EV完整性，但无法去除相似尺寸的穹窿污染。研究建议未来采用绝对定量(如数字PCR)精确分析EV内源性vtRNA，并开发抗MVP抗体的穹窿特异性分离方案。这些发现对肿瘤微环境研究、EV载药系统开发具有重要方法论指导价值。