牛精子形态功能条件下microRNAs的qPCR标准化研究及其在公牛生育力评估中的意义

这篇研究首次系统鉴定了牛(Bos taurus)精子在不同形态和运动功能条件下qPCR数据标准化的最佳microRNA（miRNA）内参，通过四种算法（delta Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper）及RefFinder综合分析，发现miR-92a-3p和Let-7c-5p分别是最稳定的精子形态和运动力分析内参，为建立精准的牛生育力miRNA标记检测体系奠定方法学基础。

　　

摘要

研究聚焦牛精子miRNA表达分析的标准化难题，针对公牛生育力评估中缺乏共识内参的现状，筛选了Let-7c-5p、miR-100-5p等6个miRNA及U6 snRNA作为候选。通过计算机辅助精液分析（CASA）和形态学评估将样本分为高/低运动力组和形态合格/缺陷组，采用TaqMan探针qPCR技术结合多算法验证，首次明确miR-92a-3p在形态分析中稳定性最佳（RefFinder评分1.18），而Let-7c-5p是运动力研究的理想内参（评分1.18），联合分析时Let-7c-5p仍表现最优。值得注意的是，传统内参U6在两类分析中均未进入前两位，而靶向PTEN通路的miR-26a-5p稳定性最差，暗示其可能作为运动力相关功能标记而非内参。

1 引言

全球15亿头牛的繁殖效率受精子质量直接影响，其中miRNA通过调控mRNA降解参与精子功能调控。尽管qPCR是miRNA定量金标准，但精子样本存在高异质性，既往研究采用PPIA基因或跨物种miRNA（如miR-425-5p）可能导致数据偏差。本研究基于人、猪等物种经验，选择序列完全保守的miRNA，旨在建立种属特异的标准化方案。

2 方法

20头安格斯公牛精液经BoviFree稀释后，按CASA参数（总运动力85.15% vs 63.19%）和形态标准（主要缺陷率12.8% vs 24%）分组。采用TRIzol结合PureLink试剂盒提取RNA，使用TaqMan Advanced miRNA试剂盒进行qPCR，循环阈值（Ct）通过四种算法评估：

• Delta-Ct：计算候选基因Ct值标准差

• geNorm：基于配对变异分析

• NormFinder：量化组内/间变异

• BestKeeper：评估原始Cp值相关性

3 结果

3.1 形态参数

缺陷组中段异常率显著（50.2% vs 22.6%），但头部异常均<10%。3.2 运动力分析高运动力组渐进运动力达80.47%（p<0.0001）。3.3 标准化分析显示：

• 运动力条件：Let-7c-5p在delta Ct（1.07）、geNorm（0.83）和NormFinder（0.63）中均居首

• 形态条件：miR-92a-3p在三种算法中稳定性第一（NormFinder评分0.57）

• 联合分析：Let-7c-5p保持最优（评分1.18），而miR-26a-5p因靶向凋亡通路稳定性最低（评分7.0）

4 讨论

研究突破在于：

1. 种属特异性：牛精子需独立于人类miR-30a-5p或猪miR-25的特异内参

2. 功能关联：高表达的Let-7c-5p在睾丸组织丰度超10⁵ reads，而miR-92a在颗粒细胞外泌体富集

3. 技术启示：反对U6的滥用，其在本研究形态分析中排名倒数第二

该成果为开发基于miRNA的公牛生育力诊断工具提供了关键方法学支持，未来可拓展至冷冻精液或疾病状态分析。