水稻特异性NLR基因RGA4L的自然变异赋予强大耐冷性及其分子机制解析

本研究通过图位克隆鉴定出水稻耐冷主效QTLqCSS12，其因果基因RGA4L编码一种特殊NLR（核苷酸结合富亮氨酸重复）蛋白。研究发现RGA4Ljap等位基因通过34-bp插入变异与OsHSP90/OsLEA5互作，激活下游通路从而增强水稻全生育期耐冷性，该基因在粳稻驯化中受到人工选择，为分子设计育种提供重要靶点。

　　

引言

水稻作为热带起源作物对低温敏感，但粳稻（japonica）因耐冷性可在高海拔/温带地区种植。研究团队利用耐冷粳稻Koshihikari与敏感籼稻Nona Bokra构建的染色体片段置换系(CSSL)，通过图位克隆鉴定出12号染色体上新型耐冷主效QTL^qCSS12，其与已知位点^qCTS12相邻但遗传重组实验证实为独立位点。

结果

2.1 耐冷QTL^qCSS12的鉴定

精细定位将^qCSS12缩小至12-kb区间，仅含一个注释基因^{LOC_Os12g10710}。通过5'-RACE技术修正其全长cDNA为4338-bp，编码1445个氨基酸的NLR类蛋白，命名为^RGA4L（与已知RGA4同源）。关键重组体R32的34-bp缺失导致^RGA4Lind等位基因C端提前终止，形成α-螺旋而非随机卷曲结构。

2.2 ^RGA4L的功能验证

RNAi敲低^RGA4Ljap导致耐冷性下降，而过表达则增强营养生长期和生殖生长期（包括花粉育性）耐冷性。田间试验显示携带^RGA4Ljap的近等基因系(NIL)在6°C自然低温下存活率显著提高，且籼稻背景导入该基因不引起产量损失。

2.3 NLR蛋白的独特机制

^RGA4L的CC结构域单独表达时可诱导烟草过敏反应(HR)，但全长蛋白无此活性，暗示LRR与NB-ARC结构域通过分子内互作抑制CC活性。亚细胞定位显示RGA4L同时定位于细胞质和细胞核，低温不改变其分布。与典型NLR不同，^RGA4L不参与稻瘟病、白叶枯病或褐飞虱抗性。

2.4 分子互作网络

酵母双杂交筛选发现RGA4L与分子伴侣OsHSP90及胚胎发育晚期丰富蛋白OsLEA5互作。Co-IP验证OsHSP90仅与^RGA4Ljap的LRR结构域结合，而34-bp缺失的^RGA4Lind丧失此能力。OsLEA5则与CC/NB-ARC结构域互作。细胞分级实验显示OsHSP90-RGA4L复合物在内质网组装后可能转运至核内激活^OsLEA5通路。

2.5 育种应用价值

^RGA4L对已报道的^COLD1、^bZIP73等耐冷基因呈现上位效应。136份品种基因型分析显示，96.55%温带粳稻携带^RGA4Ljap纯合基因型，其耐冷性（存活率>50%）显著高于籼稻（<76.06%携带敏感等位型）。

2.6 人工选择证据

515份种质资源分析发现^RGA4L在粳稻中核苷酸多样性（π=0.0006）显著低于野生稻（π=0.1410），MLHKA检测（p=0.0028）支持其受强烈正向选择。广西普通野生稻中40.19%为^RGA4Ljap/ind杂合型，暗示该变异在驯化前已存在。

讨论

研究首次揭示NLR蛋白通过OsHSP90-OsLEA5模块调控非生物胁迫的新机制。34-bp插入导致的C端构象变化可能是功能分化的关键，该发现为理解植物NLR蛋白的功能进化提供了新视角。作为首个贯穿水稻全生育期的耐冷基因，^RGA4L在分子设计育种中具有重要应用潜力。