基因编辑六倍体小麦中芹菜素含量提升促进土壤细菌固氮作用并提高低氮条件下的谷物产量

本研究通过多顺反子多重CRISPR技术编辑六倍体小麦的黄酮生物合成通路，成功获得芹菜素（apigenin）含量提升的基因编辑小麦品系。编辑植株根系分泌的芹菜素诱导固氮菌（diazotrophs）定殖并形成生物膜（biofilm），创造微氧环境保护固氮酶（nitrogenase）活性，显著提高生物固氮（BNF）效率。在限氮条件下，编辑株系表现出更高的氮含量、光合性能和谷物产量，为减少合成氮肥依赖提供了可持续解决方案。

　　

1 引言

氮素是作物生长的关键限制因子，而小麦等谷物无法直接利用大气中的氮气（N₂）。传统农业依赖合成氮肥，但氮肥利用效率（NUE）仅30%-35%，导致严重的环境污染。生物固氮（BNF）是可持续替代方案，但需克服固氮酶（nitrogenase）的氧敏感性难题。前期研究发现，黄酮类物质芹菜素（apigenin）能诱导固氮菌（如Azospirillum brasilense）形成低氧渗透性的生物膜（biofilm），从而保护氮酶活性。本研究旨在通过基因编辑六倍体小麦（Triticum aestivum）的黄酮代谢通路，验证这一策略的普适性。

2 结果

2.1 高芹菜素六倍体小麦品系的创制

通过生物信息学分析鉴定出小麦中11个CYP75B同源基因（编码黄酮3′-羟化酶F3′H），其中7个具有功能活性。设计4种gRNA靶向不同染色体上的CYP75B3和CYP75B4基因，利用tRNA多顺反子系统实现多重编辑。成功获得T₂代编辑株系（如L3、L25），其叶片和根系芹菜素含量较野生型（WT）提高3-5倍，且根系分泌物中芹菜素及其糖苷衍生物显著增加。值得注意的是，染色体1D上的CYP75B3基因编辑导致植株发育缺陷，提示该基因对小麦再生至关重要。

2.2 编辑株系在限氮条件下的表现

水培实验显示，编辑株系根系能特异性招募带noeLpro::GFP标记的固氮菌，其生物膜形成信号（GFP/mCherry比值）较WT提高2倍。16S测序分析发现，编辑株根际（rhizosphere）和根表（rhizoplane）的固氮菌比例显著增加，且nifH基因拷贝数提升50%。乙炔还原试验（ARA）和¹⁵N₂同位素标记证实，在50%和30%限氮条件下，编辑株根际固氮活性分别达到1.2 μmol C₂H₄/g土壤/小时和45‰ Δ¹⁵N，而WT几乎无活性。

大田试验中，编辑株在30%氮肥条件下表现出显著优势：单株穗数增加72%-100%，籽粒产量达WT的1.8倍。叶片氮含量（2.1% vs 1.5%）和籽粒氮含量（3.0% vs 2.1%）均显著高于WT。叶绿素含量和光合速率虽受限氮影响，但编辑株的降幅较WT减少40%，显示更好的氮素供应。

3 讨论

本研究首次在六倍体小麦中实现代谢重编程诱导的联合固氮（associative BNF）。与水稻相比，小麦CYP75B3基因的必需性提示不同物种间黄酮代谢的进化差异。生物膜形成的微环境不仅保护氮酶，还通过胞外聚合物（EPS）的物理屏障作用优化根际微生物组结构。该策略避免了传统转基因方法中氮酶异源表达的稳定性问题，且无需引入外源菌种，更具应用潜力。未来研究需评估不同土壤类型和气候条件下编辑株的稳定性，并解析芹菜素调控微生物组的分子机制。

4 实验方法

关键技术包括：多基因CRISPR载体构建（含GRF4-GIF1嵌合基因加速再生）、酵母微粒体酶活检测（验证F3′H活性）、双标记荧光菌株（mCherry/GFP）共培养、根际分区（endosphere/rhizoplane/rhizosphere）宏基因组分析，以及¹⁵N₂标记结合同位素比值质谱（IRMS）测定。统计分析采用GraphPad Prism 10.3进行ANOVA和PERMANOVA检验（Bray-Curtis距离）。