单链自切割mRNA疫苗同时表达多种病毒结构蛋白，激发强效免疫反应并保护仔猪免受PDCoV感染

本研究创新性开发了SMN-mRNA-LNP疫苗，通过单链mRNA同时表达猪δ冠状病毒（PDCoV）的S/M/N三种结构蛋白。实验证明该疫苗在仔猪主动免疫中保护率达100%（5/5），显著优于仅表达S蛋白的S2P-mRNA-LNP（4/5）。妊娠母猪接种后，初乳IgA抗体滴度达1∶105.4，较灭活疫苗提升25倍，通过母乳为新生仔猪提供完全被动保护（5/5）。该设计为冠状病毒多抗原mRNA疫苗研发提供新范式。

　　

ABSTRACT

作为新兴猪肠道冠状病毒，猪δ冠状病毒（PDCoV）对全球养猪业构成严重威胁，并具有跨物种传播潜力。研究团队首先设计表达PDCoV S2P蛋白（E855P/V856P突变）的mRNA疫苗S2P-mRNA-LNP，小鼠实验显示其诱导的体液和细胞免疫反应显著强于灭活疫苗。进一步引入P2A自切割肽，开发出可单链表达S/M/N三种结构蛋白的SMN-mRNA-LNP。仔猪免疫实验表明，SMN-mRNA-LNP组IgG/IgA抗体滴度及中和抗体水平均显著高于S2P-mRNA-LNP组，主动免疫保护率达100%（5/5）。妊娠母猪免疫后，初乳IgA滴度达1∶10^5.4，通过母乳使仔猪获得完全被动保护（5/5），显著优于灭活疫苗组（2/5）。

INTRODUCTION

冠状病毒可引发人类和动物致命性疾病，PDCoV感染导致仔猪水样腹泻和肠病理损伤，新生仔猪死亡率极高。研究证实PDCoV可跨物种感染儿童，凸显公共卫生风险。传统疫苗存在开发周期长等局限，mRNA疫苗凭借快速响应、诱导全面免疫等优势成为新方向。

PDCoV结构蛋白中，S蛋白介导病毒入侵并诱导中和抗体，M蛋白含T细胞表位，N蛋白可激活细胞免疫。当前mRNA疫苗多聚焦单一S蛋白，而自然感染中M/N蛋白参与关键免疫应答。本研究首次提出三蛋白联合策略，通过P2A连接实现单链mRNA共表达。

RESULTS

单链mRNA表达PDCoV三结构蛋白

通过P2A肽串联S2P（双脯氨酸突变）、M、N基因，Western blot和免疫荧光证实SMN-mRNA-LNP在293T/LLC-PK细胞中正确表达三蛋白。

S2P-mRNA-LNP激发强效小鼠免疫

与灭活疫苗相比，S2P-mRNA-LNP诱导更高水平的S特异性IgG/IgA（P<0.01）和中和抗体。流式显示CD3⁺CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例提升2.3倍（P<0.001），淋巴细胞刺激指数和IL-2/IL-4/IFN-γ分泌显著增强。

SMN-mRNA-LNP对仔猪的主动保护

免疫后28天攻毒显示：SMN组仔猪无腹泻症状（FC=0），肠道无病理损伤；S2P组4/5保护，灭活组2/5保护；PBS组全部发病（CT值21.13±2.63）。免疫组肠上皮PDCoV抗原检测阴性，而灭活组仍存在病毒抗原。

母猪免疫与仔猪被动保护

SMN组初乳IgA滴度达1∶10^5.4，是灭活组的25倍。关键细胞因子TGF-β1和IL-21分泌量提升3.1倍（P<0.001）。哺乳5天后，SMN组仔猪血清中和抗体滴度较灭活组高8倍，攻毒后全部获得完全保护，肠道组织学检查未见异常。

DISCUSSION

本研究突破传统单抗原设计局限，通过肠道-乳腺-sIgA轴机制，SMN-mRNA-LNP实现三重优势：

1. S蛋白预融合构象稳定，诱导高滴度中和抗体（NT50>1∶1024）

2. M蛋白激活T细胞应答，提升CD8⁺细胞毒性T细胞比例至38.5%

3. N蛋白促进IFN-γ分泌（562±43 pg/mL），增强细胞免疫

该策略为猪肠道冠状病毒疫苗研发提供新思路，未来可通过靶向肠系膜淋巴结递送进一步优化效果。研究证实多抗原协同可克服单一靶标局限，为广谱冠状病毒疫苗设计奠定基础。

MATERIALS AND METHODS

采用NanoAssemblr Ignite微流控系统制备LNP，摩尔比50:10:38.5:1.5（阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG 2000）。仔猪攻毒使用PDCoV CH/XJYN/2016株（10^4.0 TCID₅₀/mL），临床评分标准：0=正常；1=糊状；2=半液体；3=水样便。统计学分析采用GraphPad Prism进行单因素方差检验。