非洲猪瘟病毒pE146L蛋白通过二硫键介导内质网重塑促进病毒复制的分子机制

本研究揭示了非洲猪瘟病毒(ASFV)内膜蛋白pE146L通过形成分子间二硫键(C103)诱导内质网(ER)核周聚集，其脂质结合功能与病毒工厂(VF)形成密切关联。高分辨率晶体结构(2.06 ?)首次解析显示pE146L-ΔTM采用新型α/β折叠，通过正电荷表面斑块结合磷脂酰肌醇(PI4P)等酸性脂质。基因沉默实验证实pE146L缺失会导致病毒结构蛋白p72/p150错误定位，为ASFV疫苗和抗病毒药物开发提供了新靶点。

　　

非洲猪瘟病毒(ASFV) pE146L诱导的内质网重塑对病毒复制至关重要

ASFV pE146L诱导ER聚集

研究发现ASFV编码的17个跨膜蛋白中，pE146L与p54能显著诱导内质网(ER)核周聚集。通过ER分离实验和透射电镜(TEM)观察到，pE146L表达使ER形成线团状致密结构，被线粒体包裹。结构光照明显微镜(SIM)动态追踪显示，pE146L-EGFP在转染16小时后引发ER从条索状向簇状聚集的渐进式转变。

ASFV pE146L是病毒内膜晚期蛋白

免疫荧光证实pE146L在感染9小时后开始表达，qPCR显示其转录动态与晚期基因B646L(p72)同步。免疫电镜(IEM)金标定位揭示pE146L定位于病毒粒子内膜(ie)与衣壳(ca)之间的空间。DNA抑制剂阿糖胞苷(ara-C)处理实验进一步验证其为依赖病毒DNA复制的晚期表达蛋白。

pE146L缺失严重损害病毒复制

通过siRNA和CRISPR-Cas9技术构建的WSL-146sgRNA细胞系显示，pE146L敲除使病毒滴度降低2个对数单位。免疫荧光观察到p72表达显著减少，电镜显示病毒工厂(VF)内前体膜结构完全消失。有趣的是，核心壳蛋白p150仍能定位于核周DNA附近，但主要衣壳蛋白p72出现胞质弥散。

pE146L-ΔTM晶体结构揭示新型折叠

截去跨膜结构域(TM)的pE146L-ΔTM(14 kDa)晶体属P6₅22空间群，分辨率达2.06 ?。结构显示其含7个β链和3个α螺旋，形成独特的二聚体界面(954.3 ?2)，关键残基Cys103通过分子间二硫键稳定结构。表面电荷分析发现两侧存在密集正电荷区域，与脂质结合功能相关。DALI检索证实这是未见报道的新型折叠。

脂质结合功能依赖正电荷斑块

蛋白质-脂质覆盖实验显示pE146L-ΔTM特异性结合磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)等酸性脂质。脂质体共沉降实验证实其结合能力与PA浓度正相关，且可被高盐条件破坏，表明依赖静电作用。分子对接锁定R88/K82/R56/R58/R144构成的正电荷表面斑块为结合位点，这些残基突变体使病毒滴度显著下降。

二硫键介导ER聚集的关键作用

结构分析发现二聚体界面存在Thr98-Arg120氢键网络和Cys103二硫键。突变实验显示仅C103A完全破坏ER聚集，使病毒TCID₅₀降低超过100倍。凝胶过滤色谱证实C103A突变导致蛋白寡聚状态改变，说明二硫键依赖的寡聚化是ER重塑的结构基础。

该研究首次阐明ASFV通过pE146L的二硫键寡聚化驱动ER核周聚集，其脂质结合能力可能参与病毒工厂的膜微环境构建。这些发现为理解ASFV形态发生提供了新视角，C103二硫键和正电荷脂质结合位点成为抗病毒药物设计的潜在靶标。