一种基于环介导等温扩增和杂交链反应组合技术的快速检测方法，用于检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌

《Analytica Chimica Acta》：A rapid detection method for Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium in food based on the combination of loop-mediated isothermal amplification and hybridization chain reaction

基于LAMP与HCR联用的食源性致病菌快速检测方法研究。该方法通过LAMP扩增E. coli O157:H7的Z3276基因和S. Typhimurium的invA基因，结合SA-MB磁珠富集与HCR荧光信号放大，实现双重检测。实验在模型系统和真实食品（苹果汁）中验证，灵敏度达1-2 log CFU/mL（E. coli）和2-3 log CFU/mL（S. Typhimurium），总耗时＜3小时且无需预富集步骤。

　　食品中的致病菌对公共健康构成了重大威胁，因此开发快速、准确且高灵敏度的检测方法显得尤为重要。本研究提出了一种新颖的结合方法，将环介导等温扩增（LAMP）与杂交链反应（HCR）相结合，用于同时检测大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌Typhimurium。该方法首先利用LAMP技术对目标菌株的特定基因Z3276和invA进行扩增，随后通过设计的特异性序列与扩增产物进行结合反应。结合后的产物被磁珠（SA-MB）捕获，磁珠表面触发HCR反应，使用荧光标记的H2引物进行信号放大。最终，通过微量板读数仪测量荧光信号，实现对目标致病菌的快速筛查。

在实际食品样本如苹果汁中，该方法展现出高灵敏度，检测限分别为大肠杆菌O157:H7的1-2个对数CFU/mL，沙门氏菌Typhimurium的2-3个对数CFU/mL。同时，通过优化LAMP扩增、SA-MB富集和HCR信号放大步骤，整体检测时间被缩短至不到三小时。这种结合方法的优势在于无需预富集步骤，即可在真实食品中直接检测这两种致病菌，从而满足食品安全监管对快速检测的需求。

食品中有害微生物的传播途径多样，主要通过受污染的食物或水源进入人体，并在肠道内定植，引发诸如腹泻、呕吐和胃痛等症状。这些微生物不仅导致高发病率和死亡率，还带来显著的经济损失，对公众健康和安全构成严重威胁。全球范围内，由于微生物污染引发的食品事故或召回事件占比超过40%。美国疾病控制与预防中心（CDC）数据显示，每年约有4800万人感染食源性疾病，其中12.8万人需住院治疗。在欧洲，产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）和沙门氏菌是两种主要的食源性病原体，2023年报告的STEC感染病例为10,217例，沙门氏菌感染病例为77,486例。在欧盟成员国中，O157血清群的大肠杆菌是最常见的报告类型。大肠杆菌O157:H7感染可引起腹痛和出血性腹泻，严重时可能发展为危及生命的溶血性尿毒综合征（HUS）。而沙门氏菌Typhimurium感染则会导致发热，若不及时治疗，可能持续较长时间，甚至引发严重并发症和死亡。

为了实现更便捷和快速的食品中有害微生物检测，环介导等温扩增（LAMP）作为一种替代PCR技术的方法，近年来得到了广泛关注。LAMP的主要优势在于其可以在恒定的60-65°C温度下进行反应，无需传统的热循环设备，从而降低了实验成本和反应时间。此外，LAMP在灵敏度和速度方面优于qPCR或ddPCR。例如，一项利用LAMP技术检测沙门氏菌的研究表明，其检测限为2.1×101 CFU/mL，比最佳PCR方法高出10倍。另一项研究显示，LAMP技术可以成功检测出在汉堡肉和马苏里拉奶酪中0.4-4 CFU/g的李斯特菌（L. monocytogenes）初始污染。由于其高灵敏度和特异性，各种基于LAMP的检测方法，如多重LAMP、逆转录LAMP和实时LAMP，已被开发用于食品中有害微生物的检测。

杂交链反应（HCR）是一种创新的恒温扩增方法，能够在37°C下进行反应，无需酶参与，仅需一个启动DNA和两个发夹结构即可在缓冲液中引发反应。该方法自20年前首次引入以来，已被广泛应用于核酸扩增领域，结合了多种信号输出方式，如荧光用于检测miRNA，表面增强拉曼散射（SERS）用于检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）。基于这些特性，HCR可以与现有的核酸扩增方法，如PCR，相结合，进一步放大反应信号，特别适用于痕量DNA样本的检测。一项基于荧光HCR的多色、高灵敏度酶联免疫吸附测定（ELISA）平台已被开发用于同时检测大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌Choleraesuis和李斯特菌在牛奶中的存在，其检测限分别为5.4×101、1.7×101和9.8×101 CFU/mL。另一项新型夹心ELISA方法结合HCR和生物素-链霉亲和素信号放大技术，成功实现了对大肠杆菌O157:H7在全乳中的检测，检测限为2.6×102 CFU/mL。

近年来，基于功能性核酸的生物传感系统因其在快速和便携式病原体检测方面的潜力而受到广泛关注。这些生物传感策略包括双信号放大、可穿戴荧光传感器、比率和比色荧光探针等，已被成功应用于疾病诊断、环境监测和生物医学领域。值得注意的是，等温核酸扩增（INAA）技术，特别是当其与生物传感器平台结合时，已成为食品中有害微生物快速检测的强大工具，具有高灵敏度和特异性。因此，本研究探索了一种结合LAMP和无酶信号放大的方法，用于食品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌Typhimurium的同时检测。

本研究的创新点在于将LAMP和HCR技术相结合，利用其各自的优点，提高检测的灵敏度和效率。LAMP技术能够快速扩增目标DNA，而HCR技术则可以进一步放大信号，提高检测的准确性。在实验过程中，首先对大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌Typhimurium的特定基因Z3276和invA进行LAMP扩增，生成四种单环结构：Loop F（LF）、Loop Fc（LFc）、Loop B（LB）和Loop Bc（LBc）。随后，设计了针对LF和LBc的特异性结合探针，与扩增产物结合。结合后的产物被SA-MB捕获，并在磁珠表面触发HCR反应，使用荧光标记的H2引物进行信号放大。通过微量板读数仪测量荧光信号，实现对目标致病菌的快速筛查。

在评估LAMP引物特异性时，使用了沙门氏菌Typhimurium、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌和无菌去离子水作为对照。实验结果显示，当仅加入Z3276的LAMP引物时，只有大肠杆菌O157:H7样本显示出阳性扩增曲线，其他对照样本均未出现扩增，表明LAMP引物具有良好的特异性。这一结果验证了LAMP技术在特定基因扩增中的高效性和准确性。

本研究的检测方法在模型系统和真实食品样本中均表现出优异的性能。在苹果汁和PBST溶液中，对大肠杆菌O157:H7的检测限为1-2个对数CFU/mL，而对沙门氏菌Typhimurium的检测限为2-3个对数CFU/mL。通过优化LAMP扩增、SA-MB富集和HCR信号放大步骤，整个检测过程被缩短至不到三小时，显著提高了检测效率。这种结合方法的优势在于无需预富集步骤，即可在真实食品中直接检测这两种致病菌，从而满足食品安全监管对快速检测的需求。

本研究的方法不仅提高了检测的灵敏度和速度，还简化了实验流程，降低了操作难度。这对于食品安全检测实验室而言，具有重要的实际应用价值。此外，该方法的可扩展性也为其他食品中有害微生物的检测提供了新的思路。通过进一步优化引物设计和信号放大策略，未来有望将该方法应用于更多病原体的同时检测，提高食品安全检测的全面性和准确性。

在检测过程中，SA-MB的引入起到了关键作用。SA-MB不仅能够高效捕获目标DNA，还能通过其表面的HCR反应进一步放大信号，提高检测的灵敏度。此外，荧光标记的H2引物能够提供直观的检测结果，便于快速判断目标致病菌的存在与否。这种结合方法的开发为食品安全检测提供了新的技术手段，有助于提升检测的自动化水平和结果的可靠性。

综上所述，本研究开发的LAMP-HCR方法在食品中有害微生物检测方面展现出显著的优势。该方法不仅提高了检测的灵敏度和速度，还简化了实验流程，降低了操作难度。通过结合LAMP和HCR技术，实现了对大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌Typhimurium的快速、准确和高灵敏度检测，满足了食品安全监管对快速检测的需求。这一方法的推广和应用将有助于提升食品安全水平，保障公众健康。