SSA介导的选择标记基因激活系统显著提升植物基因靶向编辑效率

本研究针对植物中同源定向修复(HDR)效率低导致的基因靶向(GT)技术应用受限问题，开发了基于单链退火(SSA)机制的选择标记基因激活系统。通过CRISPR/Cas9在串联重复序列中产生双链断裂(DSB)，利用SSA修复途径恢复抗性基因功能，成功在拟南芥和水稻中实现2-23倍的GT效率提升，为植物基因组精准编辑提供了新策略。

　　

在植物基因工程领域，精准编辑基因组序列的基因靶向(Gene Targeting, GT)技术一直面临重大挑战。虽然同源定向修复(Homology-Directed Repair, HDR)途径在其他生物体中已被证明是高效精确的基因编辑手段，但在种子植物中，由于HDR效率低下和细胞壁阻碍供体模板递送等问题，GT技术的应用受到严重限制。尽管近年来工程化序列特异性核酸酶(Sequence-Specific Nucleases, SSNs)的发展为基因编辑带来了革命性突破，但植物中由CRISPR/Cas9诱导产生的双链断裂(Double-Strand Breaks, DSBs)主要通过易出错的非同源末端连接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)途径修复，仅有极少数通过精确的HDR途径完成修复，这严重制约了植物基因组精准编辑的发展。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心的研究团队在《Horticulture Research》发表了一项突破性研究。针对上述技术瓶颈，研究人员创新性地开发了一种基于单链退火(Single-Strand Annealing, SSA)机制的选择标记基因激活系统。该系统通过在非功能性分裂选择标记基因的串联重复序列中设计sgRNA靶位点，当CRISPR/Cas9在该位点产生DSB后，通过SSA途径（HDR的一个亚通路）修复，从而恢复选择标记基因的功能活性。这种策略能够富集具有高DSB和HDR活性的植物细胞，显著提高靶位点的精确编辑效率。

研究采用了多项关键技术：基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统、分裂选择标记基因（Bar和NPTII）设计、同源重组介导的基因靶向、单链退火修复机制验证、Western blotting蛋白检测等。实验材料包括拟南芥Col-0生态型和日本晴水稻品种。

研究结果部分，"Split Basta resistance gene surrogate screening system for efficient gene targeting through all-in-one strategy"显示，在拟南芥SOS1位点的GFP敲入实验中，使用Ba-ar系统的GT效率比传统方法提高2-3倍。基因型分析和测序证实所有GT事件都是精确且可稳定遗传的。

"Ba-ar surrogate system for sequential transformation strategy-mediated gene targeting"部分证明，在Demeter(DME)和Target Of Rapamycin(TOR)基因的Flag标签敲入实验中，Ba-ar系统使GT效率提升4-20倍。特别是对长达17.7 kb的TOR基因，Western blotting成功检测到TOR-Flag融合蛋白表达。

"HDR-mediated surrogate screening system for NPTII"部分开发了类似的NP-PTII系统，在拟南芥ALS基因的碱基替换实验中，GT效率提高2倍。"SSA-mediated surrogate screening system for sequential transformation strategy-mediated OsFTL1-GFP GT in rice"则将该技术拓展至水稻，在OsFTL1位点成功获得精确的GFP敲入植株。

"Enrichment of plants with high DSB and HDR activity"通过靶位点突变频率分析证实，SSA介导的筛选系统能有效富集具有高DSB和HDR活性的植物。"Further improvement by truncation of sgRNA target site"发现通过缩短sgRNA靶位点可进一步将GT效率提升7.5倍。

这项研究的重要意义在于：首先，SSA介导的抗性基因激活替代筛选系统首次实现了对高HDR活性植物的富集，突破了植物GT效率低下的技术瓶颈；其次，该系统在拟南芥和水稻中均表现出色，具有广泛的适用性；再者，所有GT事件都精确无误且符合孟德尔遗传规律，为后续研究提供了可靠工具；最后，该技术可推广至多种标记基因和植物物种，为作物分子育种提供了新思路。

在讨论部分，作者指出虽然SSA和合成依赖链退火(Synthesis-Dependent Strand Annealing, SDSA)修复途径的启动机制相同，但这是首次证明基于SSA的筛选系统能同时富集高DSB和HDR活性的植物。与以往基于NHEJ的替代系统相比，该技术更适用于精确的基因编辑。研究还探讨了单链T-DNA(ssT-DNA)可能作为植物GT修复模板的分子机制，为理解植物HDR通路提供了新视角。

这项研究建立的SSA介导抗性基因激活系统，不仅显著提高了植物基因靶向效率，也为研究植物DNA修复机制提供了新工具。随着该技术在更多植物物种中的应用，将极大推动植物功能基因组学研究和精准分子育种的发展。