利用CRISPR/Cas9技术构建espl1杂合敲除鱼模型揭示有丝分裂缺陷导致未减数精子形成及多倍体育种新策略

本研究针对多倍体形成过程中未减数配子产生的分子机制尚不明确的问题，通过CRISPR/Cas9技术在泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)中构建espl1(extra spindle pole bodies like 1)杂合敲除模型，发现espl1+/-雄性可产生二倍体未减数精子，其与野生型雌性交配可获得三倍体后代。研究首次阐明espl1杂合缺失通过干扰精原细胞有丝分裂姐妹染色单体分离导致染色体加倍，为水产多倍体育种提供了新思路。相关成果发表在《Molecular Biology and Evolution》。

　　

多倍化是生物进化和物种形成的重要驱动力，在植物和动物中广泛存在。在鱼类中，多倍体个体往往表现出生长快、抗病性强等优良性状，因此多倍体育种在水产养殖中具有重要意义。然而，未减数配子形成的分子机制，特别是精原细胞/卵原细胞有丝分裂缺陷导致的多倍体形成机制仍不清楚。此前研究发现，在植物中减数分裂缺陷会导致未减数配子形成，而在某些杂交鱼类的单性生殖品系中，精原细胞/卵原细胞的有丝分裂缺陷也会导致未减数配子产生。但具体调控这一过程的分子机制尚未阐明。

华中农业大学水产学院的研究人员选择具有天然多倍体群体的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)作为研究对象，利用CRISPR/Cas9技术构建了espl1基因杂合敲除模型。espl1编码separase蛋白，其主要功能是在有丝分裂后期催化黏连蛋白(cohesin)分解，从而促进姐妹染色单体分离。研究人员发现espl1纯合敲除导致胚胎致死，而espl1+/-雄性可以存活并产生约10%的二倍体未减数精子。这些发现为理解多倍体形成的分子机制提供了新见解，并为水产多倍体育种提供了创新策略。相关研究成果发表在《Molecular Biology and Evolution》杂志。

研究采用的主要技术方法包括：CRISPR/Cas9基因编辑构建espl1突变体、流式细胞术检测精子倍性、染色体铺片观察减数分裂构型、免疫荧光定位Espl1蛋白表达、转录组分析差异表达基因等。实验样本来自中国湖北省鄂州市的野生泥鳅群体，并通过人工繁殖获得后代。

研究结果部分：

"Expression profile of Espl1 in testis and ovary of loach"显示，Espl1在卵巢中主要表达于初级卵母细胞和生长阶段卵母细胞，在睾丸中主要定位于精原细胞和精母细胞。

"Generation of espl1 mutant loach by CRISPR/Cas9"表明，espl1-/-纯合突变导致胚胎在孵化后3-7天死亡，而espl1+/-可以存活。espl1+/-自交后代中出现约9.82%的三倍体个体。

"Discovery of unreduced sperms in espl1 mutant"通过流式细胞术和扫描电镜证实，espl1+/-雄性可同时产生单倍体和二倍体精子，而espl1+/-雌性仅产生正常单倍体卵子。

"Meiosis of espl1+/- male loaches and the effects of espl1 depletion on gametogenesis"发现espl1+/-雄性精母细胞中同时存在25个二价体（75.27%）和50个二价体（24.73%）的减数分裂构型，提示精原细胞发生了染色体加倍。

"Abnormal mitotic sister chromatid separation of espl1+/- loach led to unreduced sperm formation"通过免疫荧光观察到espl1+/-精原细胞中出现13.87%的多极纺锤体等有丝分裂异常。转录组分析发现细胞周期和姐妹染色单体分离相关基因（如ccna、ccnb1、rad21a等）表达发生显著变化。

"Production of triploid and tetraploid progeny using unreduced sperms of espl1 mutants"获得的三倍体espl1+/+/-雄性可产生三倍体精子，与野生型雌性交配获得四倍体后代。而四倍体espl1+/+/+/-雌性与二倍体雄性交配可产生全三倍体后代。

"Mutation of espl1 in zebrafish led to unreduced diploid sperm formation"在斑马鱼中也验证了espl1杂合突变可导致约5%未减数二倍体精子产生，表明该机制在鲤形目鱼类中具有保守性。

研究结论与讨论部分指出，这是首次阐明espl1杂合缺失可通过干扰精原细胞有丝分裂姐妹染色单体分离导致染色体加倍，进而产生未减数精子。这一发现不仅为理解多倍体形成的分子机制提供了新见解，更重要的是为水产多倍体育种提供了创新策略。通过espl1突变体可获得二倍体、三倍体和四倍体配子，为多倍体鱼类的创制提供了新途径。研究还发现该机制在鲤形目鱼类中具有保守性，提示espl1可能成为多倍体育种的重要靶点基因。这些发现对水产养殖业的遗传改良具有重要意义。