定向进化-基因组编辑(DE-GE)联用技术：草莓等特色作物代谢性状改良的新范式

本研究为解决特色作物育种中代谢性状精准改良的难题，开发了定向进化(DE)与基因组编辑(GE)协同的创新管道。研究人员以草莓苯丙氨酸解氨酶(PAL)为靶点，通过连续定向进化技术获得酪氨酸氨裂解酶(TAL)活性提升的突变体，结合prime editing技术实现多核苷酸精准编辑。该DE-GE管道可创造自然界不存在的酶功能变异，为作物品质改良提供全新策略。

　　

在特色作物育种领域，如何精准改良代谢性状一直是困扰研究人员的核心难题。传统育种方法周期漫长且难以实现特定代谢通路的精确调控，而第一代基因组编辑(GE)技术主要局限于基因敲除，无法实现复杂的功能增益改造。更关键的是，设计"改变功能"或"获得功能"突变需要精确知道靶基因的哪些位点需要编辑——这正是当前作物基因组编辑面临的知识瓶颈。

美国佛罗里达大学(University of Florida)园艺科学系的研究团队在《Horticulture Research》发表的研究中，创新性地将定向进化(DE)与基因组编辑技术结合，构建了DE-GE协同管道。该研究以草莓果实品质相关代谢为切入点，针对苯丙氨酸解氨酶(PAL)这一关键酶开展系统研究，通过连续定向进化获得功能优化的酶突变体，再通过prime editing技术将突变精准引入作物基因组。这项研究为作物代谢工程提供了可推广的技术框架，实现了从"随机突变"到"精准设计"的育种范式转变。

研究主要采用四大关键技术：1)基于酵母OrthoRep系统的连续定向进化平台，实现靶基因百万倍于自然突变率的超突变；2)生长偶联筛选策略，将目标酶TAL活性与酵母生长速率关联；3)多组学分析(基因组、转录组)确定草莓中7个PAL同源基因的组织特异性表达模式；4)Prime editing技术实现多核苷酸精准替换，克服传统CRISPR/Cas仅能产生indels的局限。研究使用的草莓材料来自佛罗里达大学育种项目的179个品系。

【Perspective】研究首先阐明了DE-GE管道的理论基础：传统GE技术(如CRISPR/Cas9)主要通过indels实现基因敲除，而新一代base editors和prime editors可实现精确的核苷酸替换，为代谢工程提供更多可能。但设计这些精确编辑需要预先知道哪些突变能改善酶功能——这正是DE技术的用武之地。

【Building a directed evolution-genome editing(DE-GE) pipeline for metabolic traits in specialty crop breeding】研究提出DE-GE协同管道的完整工作流程：从靶标选择、DE实验设计、突变体筛选到GE实施。该管道本质上实现了"取出基因-体外优化-回植改良"的闭环，可创造自然界不存在的合成变异。

【What directed evolution does】研究对比了经典DE与连续DE的技术特点，重点采用酵母OrthoRep系统进行连续DE。该系统通过专一性错误倾向DNA聚合酶实现靶基因超突变，突变率可达自然情况的10⁶倍，且能产生丰富的氨基酸替换类型。

【Target selection】以草莓果实苯丙烷代谢为模型，通过转录组分析从7个PAL同源基因中鉴定出果实特异性高表达的FxaPAL1(Fxa7Cg101819)作为靶标。生化分析表明，将该PAL改造为双功能PTAL(同时具有PAL和TAL活性)可绕过苯丙烷代谢的能量浪费步骤。

【Setting up DE campaigns】基于已知PAL/PTAL结构功能关系，理性设计S109I、F137H等关键突变作为DE起点。酶动力学测定显示S109I-F137H双突变体已具备基础TAL活性(k_cat/K_M=0.71 s^-1 mM^-1)，为后续DE奠定基础。

【Running DE campaigns】建立酵母生长偶联系统：通过敲除ARO8/9基因使酵母生长依赖TAL活性产生的NH₃。采用"渐减策略"逐步降低NH₃补充量，筛选获得TAL活性提升的突变体。测序鉴定关键突变后，通过体外重组酶验证确认功能改善。

【The DE→GE hand-off】针对草莓八倍体基因组复杂性，设计特异性pegRNAs实现FxaPAL1精准编辑。利用染色体7上同源基因95%序列相似性但表达模式差异，确保只编辑目标基因。S109I(需transversion)和F137H(需transition)突变分别展示prime editing的应用场景。

【From GE to breeding】编辑后的PTAL基因通过常规育种手段导入优良种质。利用HRM分析跟踪编辑事件，通过连续回交分离转基因成分。研究者强调，这种小规模精确编辑符合多数国家的监管框架，具有较好的应用前景。

这项研究构建了从靶标选择到育种应用的完整DE-GE技术管道，其核心创新在于：1)将DE的"突变发现"能力与GE的"精准编辑"能力有机结合；2)建立适用于植物酶的连续DE平台；3)解决多倍体作物精准编辑的技术难题。以草莓PAL为例，研究证实将该酶改造为PTAL可优化苯丙烷代谢流，为同时提高果实花青素含量和果皮硬度提供新策略。该管道的普适性在于，只要靶酶与目标性状存在生化关联，且作物可进行基因组编辑，就可推广应用。研究特别指出，在实施DE-GE前应检查目标突变是否已存在于种质资源中，这可以节省大量时间和成本。

这项研究的意义不仅在于技术突破，更在于育种思维的转变——从依赖自然变异到主动设计优化酶功能。正如研究者强调，当前农业生物技术领域存在"想象多于实施"的问题，而这项研究提供了从概念到实践的完整路线图。随着更多代谢通路关键酶的改造成功，DE-GE管道有望成为特色作物品质改良的常规手段，实现"设计育种"的终极目标。