RNF25-REV7信号轴：揭示DNA复制应激中叉保护的非经典机制及其在癌症治疗中的潜在价值

本研究针对DNA复制应激(DDR)中叉保护机制的关键问题，通过CRISPR-Cas9筛选发现RING指E3泛素连接酶RNF25通过非经典途径与REV7相互作用，保护HLTF介导的逆转复制叉免受MRE11/CtIP核酸酶降解。该发现揭示了独立于泛素信号通路的叉保护新机制，为靶向复制应激的癌症治疗策略提供了新靶点。

　　

在细胞分裂过程中，DNA复制就像一场精密编排的交响乐，但各种内外因素常常打断这场演奏——这就是DNA复制应激。当复制叉遇到障碍时，细胞会启动复杂的DNA损伤应答(DDR)机制，其中叉逆转形成"鸡爪"结构是重要保护策略。然而这种逆转叉犹如双刃剑，其暴露的单链DNA(ssDNA)末端极易被核酸酶降解，导致基因组不稳定甚至细胞死亡。目前已知BRCA2、FANCD2等因子能保护逆转叉，但E3泛素连接酶在此过程中的作用仍是未解之谜。

来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill)的研究团队在《Nature Communications》发表重要成果。通过创新的CRISPR-Cas9筛选，研究人员发现RING指E3泛素连接酶RNF25能通过与复制叉保护因子REV7的相互作用，形成全新的叉保护机制。令人惊讶的是，这一功能完全独立于RNF25经典的泛素信号传导活性，为理解复制应激应答开辟了新视角。

研究采用多项关键技术：1)针对317个RING指E3泛素/SUMO连接酶的CRISPR-Cas9筛选系统；2)胰腺导管腺癌(PDAC)细胞系Pa02C/Pa03C的WEE1抑制剂(AZD-1775)敏感性分析；3)单分子DNA纤维技术定量复制叉运动和降解；4)原位蛋白互作分析(SIRF)检测RNF25与新生DNA的共定位；5)免疫沉淀-质谱(IP-MS)鉴定RNF25相互作用蛋白网络。

【CRISPR筛选揭示RING指E3泛素/SUMO连接酶基因对WEE1i耐受的作用】

研究人员构建靶向317个E3连接酶的sgRNA文库，在PDAC细胞中筛选WEE1抑制剂耐受相关基因。通过Volundr算法分析发现，RNF25和PIAS1缺失显著增加细胞对WEE1i的敏感性。验证实验显示RNF25缺陷细胞在WEE1i处理后出现异常S期阻滞和G2/M期进入障碍。

【RNF25防止ssDNA积累并促进WEE1i处理细胞的S期和G2/M期进程】

RNF25缺失导致磷酸化RPA(pRPA)异常积累，表明ssDNA持续存在。活细胞成像显示RNF25缺陷细胞有丝分裂异常增加，多核细胞比例显著升高。这些现象与NF-κB、ERK信号通路无关，排除了RNF25已知功能的影响。

【RNF25与DNA复制因子相关】

IP-MS分析揭示RNF25与PARP1、TNKS1/2和REV7等复制相关蛋白存在相互作用。特别值得注意的是，RNF25能稳定REV7蛋白水平，这种相互作用在复制应激后进一步增强。

【RNF25保护逆转复制叉免受降解】

染色质分级实验显示HU处理后RNF25迅速募集到染色质。DNA纤维分析证实RNF25缺失导致复制叉降解加剧，这种表型可被MRE11或CtIP敲除挽救，而HLTF缺失则完全逆转叉降解，表明RNF25特异性保护HLTF介导的逆转叉结构。

【RNF25介导复制叉保护的结构基础】

通过构建系列RNF25结构域突变体，发现其RING结构域（而非E2结合活性）对叉保护至关重要。特别值得注意的是，破坏PAR结合位点(C198/201A)或E2结合位点(C135/138S)的突变体仍保留完整叉保护功能，证实该过程独立于泛素化活性。

【RNF25和REV7在DNA复制叉保护通路中的共同作用】

遗传学分析显示RNF25与REV7在功能上呈上位性。SIRF实验证明RNF25负责将REV7募集到新生DNA，且这种募集在复制应激时增强。TCGA数据分析显示RNF25与REV7在PDAC等多种肿瘤中存在表达相关性。

【RNF25与Polζ在DNA复制叉保护通路中的共同作用】

进一步研究发现RNF25与REV1-REV3L复合物（即Polζ）在同一通路中发挥作用，但与Shieldin复合物功能独立。值得注意的是，RNF25不参与Polζ依赖的Chk1磷酸化等其它功能，显示其作用的特异性。

这项研究揭示了RNF25-REV7信号轴作为细胞应对复制应激的新型保护机制。与传统认知不同，RNF25通过非催化性的支架作用，而非其E3泛素连接酶活性来实现叉保护功能。这一发现不仅拓展了对DNA复制应激应答的理解，更提供了潜在的治疗靶点——通过干扰RNF25-REV7相互作用可能增强肿瘤细胞对复制应激诱导剂（如WEE1抑制剂）的敏感性。研究还提出了有趣的生物学问题：RNF25如何协调其在翻译质量控制（依赖泛素化）与DNA复制（非依赖泛素化）中的双重角色？这些发现为开发选择性靶向RNF25叉保护功能的新型抗癌策略奠定了理论基础。