基于单克隆抗体的竞争性ELISA检测小反刍兽疫病毒中和抗体的开发与应用

为解决小反刍兽疫病毒(PPRV)中和抗体检测方法复杂、耗时长的问题，研究人员开发了一种基于血凝素(H)蛋白胞外域和单克隆抗体的竞争性ELISA(c-ELISA)方法。该方法的特异性和灵敏度分别达到99.38%和100%，与病毒中和试验(VNT)的符合率达96.65%，为PPRV疫苗免疫效果评估提供了高效可靠的检测工具。

　　

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的高度接触性传染病，对全球畜牧业发展和野生动物安全构成严重威胁。自1942年在西非科特迪瓦首次发现以来，该病已蔓延至非洲、中东、亚洲等70多个国家，每年造成约15-20亿美元的经济损失。尽管世界动物卫生组织(WOAH)和联合国粮农组织(FAO)制定了2030年全球根除计划，但缺乏高效、特异的检测方法仍是实现这一目标的主要障碍。

中国农业科学院兰州兽医研究所国家动物疫病防控国际联合研究中心的研究人员针对这一难题，开发了一种基于PPRV血凝素(H)蛋白胞外域(PPRV-tH)和单克隆抗体的竞争性ELISA(c-ELISA)检测方法。该研究通过原核表达系统高效制备重组PPRV-tH蛋白，利用传统杂交瘤技术筛选出具有高亲和力和中和活性的单克隆抗体，最终建立了一种可替代传统病毒中和试验(VNT)的快速检测方法。相关成果发表在《The Veterinary Journal》上。

研究采用了几项关键技术：通过大肠杆菌表达系统制备重组PPRV-tH蛋白；利用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体；采用表面等离子共振(SPR)测定抗体亲和力；通过病毒中和试验验证抗体活性；优化建立c-ELISA检测体系；使用118份阴性血清和98份阳性血清验证方法性能。

研究结果显示：

1. 抗原制备：成功表达并纯化出分子量约65 kDa的重组PPRV-tH蛋白，Western blot证实其具有良好的抗原性。

2. 单克隆抗体制备：获得3株特异性单克隆抗体(3-9hcy、10-1hcy和12-3hcy)，其中10-1hcy的亲和力最高(KD=1.96×10^-8M)，中和效价达3.91。

3. 方法建立：优化确定c-ELISA最佳反应条件为：包被抗原0.1 μg/孔，单抗稀释度1:4000，封闭液为1%牛血清。

4. 性能验证：ROC曲线分析显示该方法灵敏度99.38%，特异性100%，最低检测限为1:8稀释阳性血清，与VNT的符合率达96.65%。

这项研究建立的c-ELISA检测方法具有操作简便、快速高效的特点，能够准确评估疫苗接种后的中和抗体水平。相比传统VNT，该方法不仅大大缩短了检测时间，还实现了高通量检测，为PPR全球根除计划的实施提供了重要技术支撑。特别是该方法基于H蛋白的中和表位，可直接反映疫苗的保护效果，对野生动物和家畜的PPRV监测具有重要应用价值。研究团队开发的单克隆抗体和检测体系也为其他动物疫病的诊断方法开发提供了有益参考。