基于双催化发夹组装-DNA步行机激活CRISPR/Cas12a的无标记电化学传感平台用于肝癌标志物检测

本研究创新性地构建了基于DNA三脚架支撑界面的电化学生物传感器，通过双催化发夹组装(DCHA)-DNA步行机级联放大系统结合CRISPR/Cas12a信号转导，实现了肝癌标志物miRNA-122和AFP的超灵敏检测（检测限分别达34.02 aM和18.89 fg/mL）。该平台利用空间限域的磁珠表面反应提升效率，DNA三脚架结构优化探针取向，兼具高灵敏度和稳定性，在临床血清样本中展现出优异的诊断效能。

　　

亮点

DNA三脚架的制备

单链DNA（ssDNA）L和硫醇修饰的Sa（SH-Sa）粉末以4000 rpm离心1分钟，分别用DEPC处理的超纯水溶解制备DNA储备液（100 μM）。随后将10 μL L（100 μM）和30 μL SH-Sa（100 μM）储备液与60 μL TM缓冲液（含50 mM Tris、10 mM MgCl₂和10 mM KCl，pH=7.40）充分混合。混合物使用自动聚合酶链反应（PCR）仪进行热循环。

基于DCHA-DNA步行机-CRISPR/Cas12a级联放大电路的电化学生物传感器工作原理

示意图1展示了本研究开发的无标记电化学生物传感器的工作原理。该传感器利用DCHA驱动的DNA步行机激活CRISPR/Cas12a，构建级联放大系统用于检测miRNA-122和AFP。单链SH-Sa和L自组装形成DNA三脚架，通过多重Au-S键牢固锚定在电极表面。无靶标存在时，体系中的血红素（hemin）与DNA三脚架中鸟嘌呤富集片段结合形成G-四链体/血红素复合物，产生强电化学信号。

结论

本研究开发了一种经济高效的通用型电化学生物传感器，采用DNA三脚架作为支撑界面，结合DCHA-DNA步行机-CRISPR-Cas12a级联放大系统，实现了对miRNA-122和AFP的高灵敏度检测。DNA三脚架结构作为理想的电化学生物传感器支撑界面，在改善ssDNA探针取向的同时，促进了血红素/G-四链体组装和CRISPR/Cas12a介导的ssDNA切割，从而显著提升了检测性能。