基于DCHA-DNA步行者-CRISPR/Cas12a级联放大的DNA三脚架电化学生物传感器用于肝癌标志物miRNA-122和AFP的超灵敏检测

本研究创新性地构建了以DNA三脚架为支撑界面、结合双催化发夹组装(DCHA)-DNA步行者与CRISPR/Cas12a级联放大系统的电化学生物传感器，实现了肝癌标志物miRNA-122(检测限34.02 aM)和AFP(18.89 fg/mL)的超灵敏检测。该平台通过空间限域的DCHA反应提升步行效率，利用DNA三脚架优化探针取向，并整合CRISPR/Cas12a的非特异性切割活性，在临床血清样本中展现出优异的诊断效能。

　　

Highlight

本研究亮点在于开发了一种基于DNA纳米结构的智能传感平台，将分子步行机器人与基因编辑工具完美融合。DNA三脚架结构如同精密的分子脚手架，为后续的级联反应提供了理想的三维操作空间。

Section snippets

DNA三脚架的制备

将单链DNA(ssDNA)L和巯基修饰的Sa(SH-Sa)用DEPC处理水配制成100 μM储备液。取10 μL L溶液与30 μL SH-Sa溶液混合，加入60 μL TM缓冲液(含50 mM Tris、10 mM MgCl₂和10 mM KCl，pH=7.40)，通过PCR仪进行热循环退火：95°C加热5分钟后，以每分钟0.1°C的速率缓慢降温至25°C，最终形成稳定的三脚架结构。

基于DCHA-DNA步行者-CRISPR/Cas12a级联放大电化学生物传感器的工作原理

如Scheme 1所示，该传感器巧妙地将DCHA反应转化为DNA步行者的动力源。当目标物触发CHA1反应生成H1/H2复合物后，这些分子机器人在磁珠表面开启"散步模式"，通过CHA2反应产生大量含PAM序列的H3/H4产物。激活的CRISPR/Cas12a如同分子剪刀，高效剪切DNA三脚架上的ssDNA探针，破坏G-四链体/血红素复合物的形成，最终实现"信号关闭"式检测。这种级联放大策略使检测灵敏度达到单分子水平。

Conclusions

我们成功构建了模块化、可编程的检测平台，仅需重新设计识别模块即可切换检测不同靶标。DNA三脚架结构不仅提高了探针固定密度，更通过空间限域效应将CHA反应效率提升近3个数量级。该技术在临床样本验证中展现出卓越的鉴别能力，为肝癌早期诊断提供了突破性的解决方案。