《Microchemical Journal》：ipaH-Targeted electrochemical genosensor: A fast and reliable diagnostic approach for simultaneous detection
Shigella species and enteroinvasive
Escherichia coli
编辑推荐：
基于ipaH基因的电化学基因传感器可同步检测志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌，具有高特异性（100%）和灵敏度（50pg或102CFU/ml），稳定性达1.6年，适用于快速诊断和现场检测。
Pavithrah Shunmugam|Naveed Ahmed|Kirnpal Kaur Banga Singh
马来西亚科学大学医学院医学微生物学与寄生虫学系，16150 Kubang Kerian，马来西亚
摘要
志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）是细菌性痢疾的致病因子，已成为全球性的公共卫生问题。常规的志贺氏菌和EIEC诊断方法效率较低、耗时且劳动强度大。因此，本研究旨在开发一种电化学基因传感器检测方法，以同时检测志贺氏菌和EIEC，该方法针对ipaH基因进行检测。将生物素标记的捕获探针固定在链霉亲和素包覆的丝网印刷碳电极（SPCE）上，并与聚合酶链反应（PCR）过程中扩增的ssDNA片段杂交。通过安培检测法测量电化学响应。使用合成寡核苷酸作为检测限，该方法的可检测浓度为4 nM。在基因组和细菌细胞水平上的分析灵敏度分别为50 pg和102 CFU/ml。此外，该基因传感器的分析特异性高达100%。该检测方法的诊断性能表现出100%的特异性和灵敏度。加速老化测试表明，当存储在4°C时，该方法可稳定使用约1.6年。总之，这种用于同时检测志贺氏菌和EIEC的电化学基因传感器方法有望促进感染患者的及时和早期治疗与管理。
引言
志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）是导致人类细菌性痢疾的侵袭性病原体。众所周知，这两种病原体均源自非侵袭性大肠杆菌[1]。长期以来，区分志贺氏菌和EIEC一直是诊断实验室面临的挑战。虽然可以通过基因方法区分志贺氏菌和非侵袭性大肠杆菌，但至今尚未通过分子脱氧核糖核酸（DNA）方法区分它们[2]。
尽管大肠杆菌是一种已知的人类病原体，但关于其感染风险因素、潜在宿主或感染率的研究却非常少[3]。由于难以区分志贺氏菌和EIEC，EIEC感染常被误诊为志贺氏菌感染（因为某些菌株为乳糖阴性），或被误诊为非致病性大肠杆菌（因为某些菌株为乳糖阳性）[3,4]。此外，在泰国、中国和越南等地区，EIEC的检出率并不高[[5], [6], [7]]。EIEC感染还常与旅行者腹泻相关[4,8]。在一些研究中，即使在大量粪便样本（数百至数千份）中，EIEC的检出率也非常低[[8], [9], [10], [11]]。近年来，我们所在地区也未检测到EIEC。这可能是由于误诊所致，或者是因为该地区EIEC较为罕见。
腹泻是一种在全球范围内导致高发病率和死亡率的传染病。志贺氏菌和EIEC是引起人类细菌性痢疾的重要病原体。由于这些病原体具有高度传染性，因此开发快速检测方法至关重要。许多诊断实验室仍依赖传统的培养方法来识别这些细菌，但这种方法耗时、劳动强度大，且需要技术娴熟的实验室人员。聚合酶链反应（PCR）已被证明是检测志贺氏菌和EIEC中ipaH基因的最敏感方法[12]。尽管PCR是一种可靠的诊断工具，但传统的通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的方法存在一些缺点：制备琼脂糖凝胶并使其充分聚合需要时间。相比之下，基于安培检测的电化学生物传感器为核酸的快速灵敏检测提供了有效手段[13]。这些系统通常利用酶介导的氧化还原反应来生成与目标杂交事件相对应的电信号[14]。
为了克服这些缺点以及传统培养方法的复杂性，本研究的主要目标是开发一种能够同时检测志贺氏菌和EIEC的电化学基因传感器。该基因传感器通过在工作电极上与特异性捕获探针杂交来检测PCR过程中扩增的ipaH基因。在本研究中，加入内部扩增对照（IAC）有助于排除假阴性结果和PCR抑制现象。
部分内容
细菌菌株的鉴定、纯化和储备液制备
本研究中使用的所有细菌菌株均以15%甘油保存，储存在?70°C。如补充表S1所示，参考菌株来自美国典型培养物收藏中心（ATCC）和医学研究所（IMR）。临床菌株则来自马来西亚科学大学医院（HUSM）的微生物学诊断实验室（如补充表S2所列）。为了复苏细菌菌株，需要...
针对ipaH基因的电化学基因传感器检测方法的优化与开发
在本研究中，使用合成寡核苷酸作为阳性对照，优化了电化学基因传感器检测ipaH基因的几个关键参数。该合成寡核苷酸的目标基因长度为64 bp，能与志贺氏菌属和EIEC的ipaH基因互补。
讨论
志贺氏菌和EIEC仍然是细菌性痢疾的威胁性病原体，如果未得到适当诊断和治疗，可能会危及生命[[22], [23], [24], [25]]。不同国家的肠道病原体检出率与社会经济、卫生和气候条件有关。在马来西亚，志贺氏菌是最常见的急性胃肠炎致病菌之一，其次是沙门氏菌属、弯曲杆菌属和EPEC[[26], [27], [28]]。同样，...
结论与未来研究建议
总之，与标准诊断方法相比，用于检测ipaH基因的电化学基因传感器方法简单易行。此外，该方法具有高特异性、灵敏度和稳定性。因此，这种电化学基因传感器不仅可以在诊断实验室中使用，还可以在自然灾害等紧急情况下进行现场检测，因为其便携且方便。
CRediT作者贡献声明
Pavithrah Shunmugam：撰写初稿、软件开发、方法设计、实验设计、数据分析。Naveed Ahmed：撰写初稿、数据可视化、方法验证、资源管理、数据分析、数据整理。Kirnpal Kaur Banga Singh：审稿与编辑、方法验证、监督工作、数据整理、概念构思。
知情同意声明
已获得所有参与研究人员的知情同意。已获得患者的书面同意，允许发表本文。
机构审查委员会声明
本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得了马来西亚科学大学人类研究伦理委员会的批准（协议代码：USM-MKK/PPSP/JEPeM [248.3(10)]），适用于涉及人类样本的研究。
资金支持
本研究未接受任何外部资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
