基于核糖核蛋白的CRISPR/Cas9基因组共编辑技术在白曲霉（Aspergillus luchuensis mut. kawachii）中的建立与应用

本研究创新性地建立了白曲霉（Aspergillus luchuensis mut. kawachii）的核糖核蛋白（RNP）CRISPR/Cas9基因组共编辑体系。通过优化原生质体制备条件，成功敲除ATP硫酸化酶基因sC（赋予硒酸盐抗性），并首次在工业菌株No.8046中实现prtR（蛋白酶转录激活因子）与sC的共编辑，为丝状真菌遗传改造提供了高效精准的新工具。

　　

亮点章节

菌株与培养条件

本研究使用白曲霉（Aspergillus luchuensis mut. kawachii）NBRC 4308标准菌株和工业菌株No.8046。前者购自日本生物资源中心（NITE），后者由大阪Higuchi Mastunosuke Shoten公司惠赠。原生质体制备采用DP-磷酸盐缓冲培养基（含20 g/L糊精、10 g/L多肽蛋白胨、5 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O及200 mmol/L磷酸缓冲液[pH 7.0]），30℃培养42小时。

原生质体制备条件优化

传统Yatalase酶解法难以获得足量原生质体。本研究采用新型Yatalase-Plus酶解体系，通过优化酶解时间、温度等参数，显著提升白曲霉细胞壁降解效率——这可是让Cas9蛋白"破墙而入"的关键步骤！

作者贡献声明

竹文·辛岛（Takefumi Karashima）：实验设计、数据分析、论文撰写及可视化；小田·健（Ken Oda）与二神·大树（Taiki Futagami）：方法论指导；外园·秀树（Hideki Hokazoni）与高下·英治（Hideharu Takashita）：提供工业菌株资源。

致谢

特别鸣谢Higuchi Matsunosuke Shoten公司提供宝贵的工业用白曲霉菌株，让实验室成果向产业化迈出了关键一步！