DNMT3A介导的DNA主动去甲基化在缺氧诱导癌细胞上皮-间质转化中的关键作用

本研究揭示了DNMT3A通过其DNA主动去甲基化活性在缺氧诱导的癌细胞EMT过程中的核心调控机制。研究人员发现DNMT3A通过H3K36me3介导的招募，特异性去甲基化TWIST1和SNAIL1等EMT相关基因启动子区的HRE序列，促进HIF-1α结合和转录激活。该发现不仅首次证实了DNMTs的生理性DNA去甲基化功能，更为靶向DNMT3A去甲基化活性抑制EMT和癌症转移提供了新策略。

　　

在癌症研究领域，缺氧微环境如何触发癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)并获得转移能力，一直是科学家们致力破解的谜题。尽管已知缺氧诱导因子(HIF-1α)和组蛋白修饰参与其中，但DNA甲基化动态变化在这一过程中的调控机制仍不明确。更令人困惑的是，传统认为负责DNA甲基化的DNMTs酶家族，近年被发现具有氧化还原和Ca²⁺依赖的DNA去甲基化活性，但这些活性的生理功能长期缺乏直接证据。

来自台北医学大学医学神经科学博士项目和中研院分子生物学研究所的Biswanath Chatterjee、Pritha Majumder等研究人员，通过多学科交叉研究，首次揭示了DNMT3A的DNA主动去甲基化活性在缺氧诱导EMT中的核心作用。这项发表在《Cellular & Molecular Biology Letters》的研究，为理解癌症转移的表观遗传调控提供了新视角。

研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑、shRNA敲降、定量RT-PCR、Western blotting、ChIP-qPCR、亚硫酸氢盐测序等技术，结合全基因组甲基化测序(WGBS)和DNMT3A ChIP-Seq分析，系统研究了结肠癌SW480细胞在缺氧条件下的表观遗传重编程。研究还通过EMT实验、伤口愈合实验和肺定植实验验证了表型变化。

"缺氧诱导的全基因组DNA去甲基化需要DNMT3A"部分显示，缺氧处理导致SW480细胞全基因组DNA显著去甲基化，而敲除DNMT3A后这种变化消失。通过LC-ESI-MS/MS定量分析证实，缺氧条件下基因组5-mC含量下降约30%，且这一过程依赖于DNMT3A的表达。

"DNMT3A对缺氧诱导EMT基因转录的调控"部分揭示，DNMT3A特异性调控TWIST1和SNAIL1等EMT核心基因的表达。亚硫酸氢盐测序显示，TWIST1启动子区HRE位点(-81bp)的CpG在缺氧时发生显著去甲基化(从86%降至70%)，而DNMT3A敲除后这种去甲基化被完全阻断。

"EMT过程中TWIST1启动子的HIF-1α结合、DNMT3A结合和组蛋白PTM变化"部分通过ChIP-qPCR和ChIP-Seq证实，缺氧诱导H3K36me3标记在TWIST1启动子区富集，进而招募DNMT3A。时序实验显示，DNMT3A在缺氧6小时后即结合至启动子区，而HIF-1α结合则延迟至12小时后出现。通过构建C710A(丧失甲基化和去甲基化活性)和R885A(仅丧失甲基化活性)突变体，研究在"DNMT3A的DNA去甲基化活性对缺氧诱导SW480细胞EMT的必要性"部分证实，只有保留去甲基化活性的R885A突变体能恢复缺氧诱导的EMT表型。

研究还发现DNMT3A的这一调控机制具有普适性。在"DNMT3A参与缺氧介导的EMT不仅限于结肠癌细胞"部分，乳腺癌MCF-7和肝癌Hep G2细胞中同样观察到DNMT3A依赖的缺氧诱导EMT现象。

这项研究的重要意义在于：首次证实了DNMT3A的生理性DNA去甲基化功能；揭示了H3K36me3-DNMT3A-HIF-1α级联反应是连接氧感应通路与表观遗传调控的关键桥梁；提出了靶向DNMT3A去甲基化活性抑制EMT和癌症转移的新策略。特别是发现DNMT3A-R885A突变体仅丧失甲基化活性而保留去甲基化活性的特性，为开发选择性抑制剂提供了重要靶点。这些发现不仅深化了对癌症转移机制的理解，也为开发新型抗转移药物指明了方向。