甲型流感病毒5′端片段特异性非编码区双重调控机制：竞争性多片段RNA转录与选择性基因组包装的协同作用

这篇研究揭示了甲型流感病毒(IAV)5′端片段特异性非编码区(ssNCR)的双重调控机制：通过RNA二级结构动态变化，在感染过程中同时协调多片段竞争性转录效率（模板竞争性mRNA合成）和选择性基因组包装（vRNA掺入子代病毒体）。该发现突破了传统认知中ssNCR仅作为包装信号的局限，为理解负链RNA病毒基因表达调控提供了新范式。

　　

5′端片段特异性非编码区调控流感病毒复制的双重机制

ABSTRACT

甲型流感病毒(IAV)基因组8个RNA片段的3′和5′端存在片段特异性或亚型特异性非编码区(ssNCR)，位于高度保守的启动子序列与编码区之间。传统认知中这些区域主要参与基因组选择性包装，但本研究首次揭示5′端H1-ssNCR通过局部RNA结构动态变化，在感染过程中同时调控多片段竞争性转录和vRNA包装效率。

INTRODUCTION

IAV作为引起全球流行的重要病原体，其vRNP复合物中NP蛋白的非均匀分布会暴露特定RNA区域形成二级/三级结构。既往研究认为3′和5′端ssNCR主要作为包装信号，但本团队前期发现3′端H1-ssNCR协同相邻编码区调控HA vRNA复制。本研究聚焦5′端ssNCR，通过系统截短突变揭示其全新功能。

RESULTS

5′端H1-ssNCR截短导致病毒减毒

在WSN(H1N1)反向遗传系统中构建8个5′端H1-ssNCR截短突变体（5′L1-5′L8，每次删除3nt）。发现5′L8（删除U stretch与终止密码子间24nt）导致病毒滴度下降>2 log，而保留U stretch邻近3nt的5′L1-5′L7仅轻度影响病毒增殖。生长曲线显示5′L8在MDCK细胞中复制严重受损。

截短突变影响HA vRNA包装与蛋白表达

M-RT-PCR显示5′L8病毒颗粒中HA vRNA含量显著降低，Western blot证实HA/M1蛋白比例下降。单周期感染实验发现5′L8在细胞内vRNA水平正常但HA蛋白表达减少，提示5′端ssNCR同时调控包装和翻译效率。

多模板系统中转录效率的竞争性调控

在单模板RNP重构系统中，所有截短体均能正常转录复制；但在多模板系统中，5′L8的HA mRNA水平骤降。NA片段等效突变体（NA-5′Ld）重现该现象，证实5′端ssNCR具有跨片段的转录调控功能。双模板竞争实验使用含His标签的野生型对照，证实5′L8转录竞争力显著弱于野生型。

适应性突变G1724A的双重挽救

5′L8病毒传代时在第6代出现G1724A突变（截短位点上游7nt处）。该突变使病毒滴度恢复至野生型水平，结构预测显示其破坏截短导致的过度稳定双链区（MFE从-8.6升至-3.8 kcal/mol）。PAT assay证实该突变不改变poly(A)尾长度，但通过重构RNA局部结构同时恢复mRNA转录竞争力和vRNA包装效率。

RNA二级结构的双重调控模型

icSHAPE与PARIS数据揭示5′端ssNCR与邻近ORF形成动态结构：U stretch位于单链环时功能正常，嵌入双链区则损害功能。引入人工突变验证结构-功能关系：沉默突变U1718C/U1721G维持稳定结构表型，而G1724C与天然突变G1724A同样通过增大环区挽救功能。

DISCUSSION

本研究突破性发现5′端ssNCR通过动态RNA结构实现"一区双效"：在转录层面，其局部结构可能影响RdRp在终止阶段的模板选择；在包装层面，暴露的单链区作为构象开关介导vRNP特异性互作。与3′端ssNCR主要调控复制的功能形成互补，共同完善了IAV基因表达调控网络。该机制为开发靶向非编码区的广谱抗病毒策略提供新思路。

MATERIALS AND METHODS

实验采用WSN(H1N1)八质粒反向遗传系统，通过NH₄Cl阻断多周期感染研究单周期表型。RNP重构系统包含复制缺陷型PA-C95A突变体专用于转录研究。采用M-RT-PCR、银染、PAT assay等多组学方法全面解析RNA代谢过程。统计采用ANOVA与Dunnett多重检验，显著性阈值设为<0.01。