环状四腺苷酸诱导蛋白二聚体四聚化激活CRISPR相关PIN核酸酶的新机制

本研究揭示了Saccharolobus islandicus中新型效应蛋白CaPN通过cA4结合触发二聚体四聚化，从而激活PIN结构域核酸酶活性的分子机制。研究人员综合运用生物化学、遗传学和结构生物学方法，阐明了III型CRISPR-Cas系统中cA4信号传导通路的新效应器作用机制，为理解原核生物抗病毒防御系统的多样性提供了重要见解。

　　

在微生物与病毒持续博弈的进化长河中，CRISPR-Cas系统作为原核生物的"免疫系统"发挥着关键作用。其中III型CRISPR-Cas系统通过合成环状寡腺苷酸(cOA)第二信使激活下游效应蛋白，但大量CARF(CRISPR-associated Rossman fold)效应蛋白的功能机制仍属未知。Saccharolobus islandicus REY15A中编码的CaPN蛋白具有独特的CARFm3结构域与PIN结构域组合，其激活机制和生物学功能亟待阐明。

山东大学微生物技术国家重点实验室的研究团队通过系统的实验解析，发现CaPN能够特异性识别III-B型Cmr系统产生的环状四腺苷酸(cA4)，但不同于已知的自我限制型效应蛋白，CaPN不具备cA4降解活性。研究人员采用微量热泳动(MST)测定结合亲和力，高效液相色谱(HPLC)分析cA4稳定性，体外核酸酶活性实验以及晶体结构解析等技术手段，揭示了CaPN的新型激活机制。

cA4特异性感知与结合特性

通过MST结合实验证实CaPN对cA4具有高亲和力(K_d=16.9 nM)，而对cA3和cA6无结合能力。晶体结构解析显示cA4结合诱导CARF结构域构象变化，关键结合残基包括9SDK¹¹、T14、D38、90RK91和Y108等，其中90RK91双突变同时丧失cA4结合和RNA酶活性。

独特的四聚化激活机制

凝胶过滤色谱和晶体结构分析表明，cA4结合促使CaPN二聚体进一步形成四聚体。比较apo和cA4结合状态的结构发现，四聚化过程重新定位了PIN结构域催化口袋中的关键残基D296，使其从远离活性中心的位置移动到类似天然活性VapC毒素的构象。

广谱RNA酶活性与底物偏好

体外实验证实激活后的CaPN可切割单链RNA而非双链RNA或DNA，对tRNA表现出特定序列偏好，尤其擅长切割含GG位点的V环区域。核糖体RNA和总RNA降解实验进一步证明其广谱RNA酶活性可导致细胞生长停滞。

遗传学验证与生理功能

在S. islandicus中，同时表达CaPN和激活Cmr-α系统的crRNA导致细胞生长完全抑制，细胞体积异常增大。通过构建CARF和PIN结构域关键残基突变体，证实二者对CRISPR免疫防御均不可或缺。

该研究首次阐明了一种通过cA4诱导蛋白四聚化来激活核酸酶的新型机制，拓展了对CRISPR信号通路的认知。CaPN代表了一类独特的CARF-PIN融合蛋白家族，其四聚化激活模式为设计可调控核酸酶提供了新思路。研究发现这类蛋白仅存在于嗜热古菌中，暗示其在高温环境适应中的特殊进化意义。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为理解原核生物抗病毒防御系统的多样性做出了重要贡献。