解锁遗传潜能：利用噬菌体辅助进化系统实现靶向诱变的技术突破

研究人员针对DNA文库构建中脱靶突变的关键挑战，开发了将噬菌体辅助进化与MutaT7靶向诱变系统结合的eMPAE技术。该系统能在基因靶区（GOI）产生高达9个突变（5.6 mutations kb-1 day-1），完全消除6600 bp质粒的脱靶突变（<6.2×10-3 mutations kb-1 day-1），并通过限制性酶切位点实现GOI和DNA修饰酶的灵活替换。实验证明eMPAE产生的蛋白变体在结合实验中优于亲本蛋白，为定向进化提供了变革性工具。

　　

在蛋白质工程领域，如何高效构建多样性突变库一直是制约定向进化发展的瓶颈问题。传统方法如MP6全局诱变质粒虽然能提高突变率，但会产生大量脱靶突变，导致"作弊噬菌体"（cheater phages）的产生——这些假阳性突变会绕过选择压力，严重影响实验结果的可靠性。与此同时，现有靶向诱变系统如eMutaT7虽然能限制突变范围，但在噬菌体辅助进化（PACE）条件下突变效率不足，难以满足实际需求。

针对这一双重挑战，加拿大多伦多大学（University of Toronto）的研究团队开创性地将噬菌体辅助进化与靶向诱变系统相结合，开发出增强型突变噬菌体辅助进化系统（eMPAE）。这项发表在《Nucleic Acids Research》的研究通过巧妙设计，实现了在目标基因区域（GOI）的高效精准诱变，同时将质粒其他区域的脱靶突变降至可忽略水平。

研究人员主要运用了三大关键技术：1）构建含T7启动子/终止子的选择噬菌体（SP）质粒系统，通过高效T7hyb10终止子（98%终止效率）限制突变范围；2）开发MPT7诱变质粒，整合细菌密码子优化的胞嘧啶脱氨酶（pmCDA1）与T7 RNA聚合酶融合蛋白；3）建立细菌单杂交（B1H）筛选平台，评估突变体与靶DNA（invHixC）的结合能力。这些方法协同作用，实现了从突变生成到功能验证的全流程优化。

SP质粒改造实现精准定位

通过插入T7启动子和高效终止子T7hyb10，研究人员将突变限制在GOI区域。为解决早期实验中噬菌体增殖不足的问题，他们在终止子下游添加了弱启动子驱动必需噬菌体基因（gVI/gI/gXI）表达，使噬菌体滴度提高100倍。值得注意的是，当GOI长度不足时（原仅291 bp），突变效率显著降低；通过增加连接序列将靶区（ROI）延长至959 bp后，成功获得理想突变效果。

MPT7诱变系统优化

研究团队对诱变质粒进行了三重改进：首先引入SD序列增强尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）表达，防止突变修复；其次将pmCDA1第187位色氨酸恢复为精氨酸（W187R）；最后采用细菌密码子优化的pmCDA1（CAI 0.93），显著提升蛋白表达水平。这些改进使突变率达到5.6 mutations kb^-1 day^-1，远超eMutaT7的1.2 mutations kb^-1 day^-1。

突变特征分析

测序结果显示，经过4轮漂变（drift）后，目标区域积累3-9个突变，且全部为C-to-T过渡突变。全质粒测序证实，在6.6 kb的SP质粒中，除GOI外未检测到任何突变，脱靶突变率<6.2×10^-3 mutations kb^-1 day^-1。特别值得注意的是，T7启动子区域仅出现单个保守位点突变，不影响系统持续运行。

功能验证与应用

在针对植物转录因子HZ的进化实验中，经过三轮选择获得三个稳定突变：R40C、L83（沉默突变）和Q84（无义突变）。细菌单杂交实验显示，含R40C和Q84的双突变体（C）对invHixC靶点的结合能力显著优于野生型。尤为意外的是，Q84突变虽然截短了亮氨酸拉链结构域，却展现出更强的DNA结合活性，这一反直觉结果凸显了定向进化发现非理性设计突变的优势。

这项研究通过eMPAE系统成功解决了靶向诱变效率与特异性的平衡难题。其创新性体现在：1）首次将噬菌体辅助进化与T7靶向系统有机结合；2）通过细菌密码子优化和UGI表达增强显著提升突变效率；3）严格的终止子设计确保零脱靶突变。该系统为需要构建大型突变库的研究（如酶工程、抗癌蛋白开发）提供了强大工具，特别适用于初始活性较低的蛋白优化。未来通过整合腺嘌呤脱氨酶等多元诱变元件，可进一步扩展突变谱系，推动定向进化技术向更高精度发展。