光化学与化学遗传学调控CRISPR-Cas9和Cas12的通用型抗CRISPR平台

本研究针对CRISPR-Cas系统缺乏多维度调控工具的难题，开发了基于工程化抗CRISPR蛋白(Acr)的通用型控制平台CASANOVA/CASANDRA。通过将光敏LOV2结构域和新型环化受体(cpReceptor)插入AcrIIA5、AcrVA1等广谱抑制剂，实现了对II型(SpyCas9/SauCas9/NmeCas9)和V型(MbCas12a)CRISPR效应器的光控与药物诱导调控，其AAV递送系统在多种人类细胞中展现出19倍动态调控范围，为精准基因组编辑提供了模块化工具箱。

　　

在基因编辑技术飞速发展的今天，CRISPR-Cas系统犹如一把"分子剪刀"彻底改变了生命科学研究格局。然而这把剪刀的操控仍存在关键瓶颈——如何实现时空特异性的精准控制？现有调控工具往往受限于单一Cas变体、不可逆激活或有限应用场景，就像试图用固定焦距的镜头拍摄动态画面。更棘手的是，广泛使用的Cas9和Cas12a等II型、V类效应器缺乏通用调控方案，严重制约了其在基础研究和临床治疗中的应用潜力。

海德堡大学(Heidelberg University)药学和分子生物技术研究所的Luca Brenker团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究中，巧妙利用自然界存在的"分子刹车"——抗CRISPR蛋白(Acr)，构建了名为CASANOVA(光控)和CASANDRA(化学控)的双模式调控平台。研究人员通过AlphaFold³预测指导，将光敏LOV2结构域和创新的环化受体(cpReceptor)插入AcrIIA5、AcrVA1等广谱抑制剂的柔性区域，成功实现了对多种CRISPR系统的远程遥控。该平台不仅能通过蓝光脉冲精确开关Cas9活性，还能用皮质醇(COR)、他莫昔芬(4-OHT)等六种临床药物按需调控，在人类原代肝细胞(PHHs)等模型中验证了其治疗潜力。

关键技术包括：(1)基于结构预测的LOV2/cpReceptor位点筛选；(2)多正交AcrIIA5变体活性评估；(3)混合pol-II/III启动子构建AAV兼容载体；(4)双荧光素酶报告系统定量调控效率；(5)T7E1和NGS分析基因组编辑动态范围。

AcrIIA5耐受LOV2插入实现光控Cas9

通过系统评估7种AcrIIA5直系同源物，选择链球菌噬菌体来源变体进行结构改造。在D41和N77位点插入LOV2构建的CASANOVA-A5，使SauCas9在EMX1位点的编辑效率产生显著光控差异(P<0.001)。

特别设计的(GGS)₂ linker使N77变体获得更低本底活性，通过工程化H1-U6杂交启动子实现单载体AAV包装(4.6 kbp)。

cpReceptor实现多药物调控

创新性地将雌激素受体β(ERβ)等受体在已知分裂位点环化，构建的cpGR2插入AcrIIA5后，1μM COR处理使HEK293T细胞中NmeCas9对F8位点的编辑抑制达80%。

这种"分子发卡"结构显著优于传统UniRapR系统，AAV3递送时调控窗口扩大至19倍。

跨细胞类型与CRISPR系统普适性

在HCT116结肠癌细胞中，AcrIIA5-cpGR2对GRIN2B位点的调控效率达75%。

通过删除S103-I109螺旋构建的CASANOVA-VA1，首次实现Cas12a的光控编辑，为V型效应器调控开辟新途径。

这项研究突破了现有CRISPR调控工具的三个关键局限：通过广谱Acr实现多Cas变体兼容；创新cpReceptor支持六种临床药物输入；模块化设计适用于dCas9-VP64等衍生系统。特别值得注意的是，研究者开发的环化受体技术(cpReceptor)为合成生物学提供了新型"变构开关"设计范式，其邻近末端(N/C)特性克服了传统激素受体在插入融合时的空间位阻难题。正如作者强调的，该平台在原发性人类肝细胞中的成功验证，为未来实现组织特异性基因治疗奠定了坚实基础，或将推动CRISPR技术向"精准医疗时代"迈出关键一步。