利用互补防御系统增强嗜热链球菌的噬菌体抗性：从CRISPR-Cas到新型辅助防御机制的全面探索

本研究针对乳制品发酵中噬菌体感染导致的生产停滞问题，通过系统分析263株嗜热链球菌(S. thermophilus)的防御组(defensome)，发现21种辅助防御系统（包括13种首次在该物种中验证的机制）。实验证实17种系统对5个噬菌体属具有广谱或特异性抑制作用，其中Gabija、Hachiman等与CRISPR-Cas联用可协同抵抗携带抗CRISPR蛋白(ACR)的噬菌体。研究还证明这些系统的染色体整合不影响工业菌株的发酵性能，为开发抗噬菌体发酵菌株提供了新策略。

　　

在乳制品工业中，嗜热链球菌(S. thermophilus)是酸奶和奶酪生产的关键发酵菌种，但噬菌体感染常导致发酵失败，每年造成巨额经济损失。尽管CRISPR-Cas系统和限制修饰系统(RM)被认为是细菌对抗噬菌体的核心武器，约40%的噬菌体已进化出抗CRISPR蛋白(AcrIIA等)和基因组修饰等逃逸机制，使得现有防御策略面临严峻挑战。

加拿大拉瓦尔大学(Université Laval)的研究团队在《Nature Communications》发表的研究，首次系统探索了嗜热链球菌的"防御组"(defensome)。通过对263株菌的基因组分析，研究人员不仅确认了CRISPR-Cas和RM系统的主导地位，更发现了21种新型辅助防御系统，其中13种从未在该物种中被研究过。实验验证显示，这些系统能针对不同噬菌体属（如Moineauvirus和Brussowvirus）提供1-7个数量级的保护效果，特别是当与CRISPR-Cas联用时，可产生协同效应，有效对抗携带AcrIIA6等抗CRISPR蛋白的噬菌体。

研究采用多组学联用策略：① 通过DefenseFinder和PADLOC软件预测防御系统；② 使用低拷贝质粒pTRKL2进行系统功能验证；③ 构建CRISPR-免疫菌株与辅助系统组合模型；④ 采用自然转化法将防御系统整合至工业菌株DGCC7710染色体；⑤ 通过噬斑形成试验(EOP)和液体杀伤实验评估防御效率。

S. thermophilus防御组超越CRISPR-Cas和RM系统

生物信息学分析揭示平均每个菌株携带7.5种防御系统，除CRISPR-Cas和RM外，还鉴定出21种辅助系统。其中AbiD最为普遍（占28%菌株），而Gao19、Gabija等新型系统虽分布较少但功能强大。

噬菌体的反防御策略

40%噬菌体编码AcrIIA家族蛋白，其中AcrIIA6可特异性抑制CR1位点的Cas9活性。基因组分析还发现噬菌体通过减少GATC等限制酶切位点来逃避RM系统。

辅助防御系统的抗噬菌体活性

实验测试18种系统对16株噬菌体的抑制效果，Gabija和Hachiman展现广谱活性（对全部测试噬菌体有效），而AbiH等仅针对特定噬菌体属。值得注意的是，Gao19的不同同源体（如Gao19ST3与Gao19ST109）表现出显著的功能差异。

防御系统组合增强免疫

CR1-CRISPR与Gabija联用可使噬菌体2972滴度降低至检测限以下，对携带AcrIIA6的噬菌体D5691也实现完全抑制。液体培养实验显示，在感染复数(MOI)0.5-50范围内，这种组合呈现显著协同效应（p<0.05）。

染色体整合无适应性代价

将PD-Lambda-1或Hachiman+RMII防御岛整合至工业菌株染色体后，既保持高效抗性（EOP<10^-7），又不影响牛奶酸化速率（pH下降速率1.27×10^-2单位/分钟）。但非原生位点整合的Thoeris等系统可能影响发酵性能。

这项研究突破了传统依赖CRISPR-Cas的单一防御思路，首次在嗜热链球菌中构建了多层次防御体系。特别重要的是，发现的Gabija等系统能有效中和携带ACR的噬菌体，解决了工业菌株面临的最大威胁。通过"金字塔式"防御策略（将多种系统整合至单菌株），相比混合培养策略可降低99%的噬菌体逃逸概率。研究不仅为乳制品工业提供了新型抗噬菌体菌株开发路线，其揭示的防御机制协同原理（如DNA降解与NAD⁺耗竭联用）更为其他病原菌防控提供了范式。随着冷冻电镜等技术的应用，这些防御系统的分子机制解析将成为下一步研究重点。