多癌种诊断新突破：酶处理RNA测序揭示体液中rsRNA和tsRNA的广谱生物标志物潜力

本研究针对传统RNA测序技术难以全面检测修饰RNA的局限，创新性采用酶处理RNA测序（PANDORA-seq）系统解析六种人体体液及多物种血清中的细胞外RNA（exRNA）图谱。研究发现核糖体RNA衍生小RNA（rsRNA）和转运RNA衍生小RNA（tsRNA）在体液中高度富集，并构建出基于6种exRNA的机器学习模型，在69例癌症患者血清检测中实现94.1%灵敏度和100%特异性的诊断效能。该成果发表于《iScience》，为无创癌症早诊提供了新型分子标志物体系。

　　

在精准医疗时代，液体活检技术正面临重大瓶颈——传统检测方法仅能捕获约1000种miRNA，而大量具有诊断潜力的修饰RNA因技术限制成为"暗物质"。更棘手的是，RNA末端的化学修饰会阻碍测序接头连接，内部修饰则影响逆转录效率，这使得常规RNA测序难以揭示完整的细胞外RNA（exRNA）图谱。这种技术局限严重制约了癌症早期诊断的敏感性和特异性提升。

南京大学医学院附属鼓楼医院和南京大学医药生物技术国家重点实验室的研究团队另辟蹊径，采用创新的酶处理RNA测序技术（PANDORA-seq），系统解析了血清、腹水、尿液、乳汁等六种人体体液及小鼠、大鼠等多物种血清中的exRNA组成特征。研究发现核糖体RNA衍生小RNA（rsRNA）和转运RNA衍生小RNA（tsRNA）在体液中高度富集，且具有显著的体液特异性和物种特异性。基于120例临床血清样本（51例健康对照和69例五种癌症患者）构建的机器学习模型，仅用6种exRNA标志物就实现了94.1%的灵敏度和100%的特异性，相关成果发表在交叉学科期刊《iScience》上。

研究团队运用三大关键技术：1）AlkB和T4PNK双酶处理消除RNA修饰对测序的干扰；2）跨物种、多体液（人类六种体液+四种动物血清）的exRNA组学分析；3）机器学习算法（随机森林和LASSO）筛选诊断标志物。临床样本来自南京大学医学院附属鼓楼医院经伦理审查的队列。

【Landscape of rsRNAs enrichment in exRNAs across diverse human biofluids】

通过传统RNA-seq与酶处理RNA-seq对比发现，常规方法严重低估rsRNA含量。在血清中，酶处理使rsRNA检出量提升20倍，成为最丰富exRNA（占比>50%）。乳汁中rsRNA/miRNA比值最高达300:1，揭示其作为诊断标志物的潜在优势。

【Characterization of rsRNAs and tsRNAs in human biofluids under enzymatic treatment RNA-seq】

18S和28S rRNA衍生的rsRNA占主导，15,033-338,664种rsRNA具有体液特异性。tRNA反密码子环两侧最易产生tsRNA，其中i-tRF亚型含量最高。体液间仅共享17,077种rsRNA（<5%），表明exRNA具有显著的组织来源特异性。

【Cross-species analysis of serum-derived exRNAs】

跨物种分析显示tsRNA在动物血清中占优，而人类以rsRNA为主。12S/16S rRNA衍生rsRNA存在显著种属差异，提示进化过程中的功能分化。

【Analysis of serum-derived exRNAs across multiple cancers to identify tumor-associated exRNAs signatures】

随机森林算法筛选出20个exRNA标志物（18个为rsRNA），优化后的6标志物组合在独立验证集实现近乎完美的诊断效能（AUC=1.0）。

【Tumor-derived exRNA profiles classify primary tumor of origin】

LASSO回归鉴定出11种exRNA可区分肝癌（涉及糖醛酸代谢通路），7种exRNA识别前列腺癌（Wnt通路相关），展现"一癌一谱"的精准分型能力。

这项研究首次系统绘制了酶处理RNA测序揭示的"rsRNA优势型"exRNA图谱，突破性地将癌症诊断标志物库从miRNA扩展到rsRNA/tsRNA领域。特别值得注意的是，rsRNA在血清中的含量远超预期，其与tsRNA共同构成的"分子条形码"不仅能区分癌与非癌，还可追溯肿瘤组织起源。技术层面，AlkB/T4PNK处理方案成功攻克了RNA修饰导致的测序偏倚，为表观转录组学研究提供新工具。临床转化方面，研究建立的六标志物组合具有商业化潜力，其94.1%的灵敏度已接近组织活检金标准。未来需在更大队列中验证这些标志物的稳定性，并深入探究rsRNA/tsRNA的分泌机制和生物学功能，这些发现或将重塑液体活检技术格局。