CRISPR/Cas9介导PD-1基因编辑增强肝癌浸润淋巴细胞疗法的抗肿瘤效应研究

肝癌免疫治疗面临T细胞功能耗竭难题！中南大学团队创新性采用CRISPR/Cas9技术靶向编辑TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）的PD-1基因，证实PD-1敲除可显著提升T细胞杀伤功能并维持TCR克隆多样性，在PDX模型中展现卓越抑瘤效果，为实体瘤基因修饰细胞疗法提供新策略。

　　

肝癌作为全球第三大癌症死因，五年复发率高达70%，其免疫抑制微环境导致T细胞耗竭是治疗失败的关键。尽管PD-1/PD-L1抑制剂在部分患者中展现疗效，但响应率有限。肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocyte, TIL）疗法虽在黑色素瘤取得突破，却在肝癌中效果欠佳，主要归因于TILs在体外扩增过程中PD-1高表达导致的功能抑制和T细胞受体（TCR）克隆多样性丢失。

中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗研究所的研究团队在《Translational Oncology》发表创新研究，首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于肝癌TILs的PD-1（PDCD1基因）敲除，通过26例患者样本分析、TCR测序和PDX模型等系统评估，证实PD-1编辑可显著增强T细胞抗肿瘤功能。研究采用三大关键技术：1）从手术切除的肝癌组织分离TILs并体外扩增；2）通过电转CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物靶向PDCD1基因；3）利用患者来源异种移植（PDX）模型评估编辑后T细胞的体内疗效。

研究结果揭示：

【CRISPR/Cas9系统实现高效稳定PD-1编辑】

sgRNA靶向PDCD1基因外显子1区域，在7例患者中平均编辑效率达43.68%，最高达66.8%。Western blot显示PD-1蛋白表达显著降低（p<0.05），且编辑效果可稳定维持至培养第21天。

【PD-1编辑维持T细胞表型稳定性】

流式细胞术分析显示，编辑组与未编辑组在CD4⁺/CD8⁺T细胞的效应记忆亚群（TEM）、中央记忆亚群（TCM）等表型无显著差异，但PD-1⁺细胞比例显著降低（CD8⁺T细胞从35.5%降至16%，p<0.001）。值得注意的是，其他免疫检查点（TIM-3、LAG-3等）未出现代偿性上调。

【TCR克隆型保留肿瘤特异性优势】

通过VDJdb数据库分析发现，编辑组保留的肿瘤特异性TCR克隆比例较未编辑组高32%（p=0.0176）。Morisita-Horn指数显示编辑组TCR与原始肿瘤样本相似性更高（p=0.059），且前10位高频克隆在编辑组中保持更优的克隆频率（p<0.05）。

【体外体内验证抗肿瘤效能】

编辑组CD8⁺T细胞的颗粒酶B（80% vs 54.5%）和IFN-γ（66% vs 30.5%）分泌显著增加（p<0.01）。在PDX模型中，编辑组肿瘤体积抑制率较未编辑组提高2.3倍（p<0.01），TUNEL检测显示肿瘤细胞凋亡增加，Ki-67⁺增殖细胞减少。RNA测序证实编辑组T细胞中IFNG、GZMB等效应基因及IL2RA等激活标记基因显著上调。

该研究突破性地证明：CRISPR/Cas9介导的PD-1编辑不仅能解除T细胞抑制，还可通过维持TCR克隆多样性增强肿瘤识别广度。特别值得注意的是，编辑后的TILs在扩增过程中优先保留肿瘤特异性克隆，这一发现为克服当前TIL疗法克隆丢失难题提供新思路。研究建立的PD-1编辑方案具有临床转化潜力，其采用的PDX模型高度模拟人体微环境，为肝癌等实体瘤的基因修饰细胞疗法奠定重要基础。未来研究可进一步优化编辑效率，探索与CAR-T等技术的联合应用策略。