诱饵细胞外囊泡通过膜-胞质-线粒体级联靶向克服三阴性乳腺癌异质性

这篇研究创新性地开发了siT/MOF@EVs递送系统，通过"诱饵"细胞外囊泡（EVs）阻断多重免疫检查点（PD-1/TIM-3/TIGIT），同时递送TEAD4-siRNA和线粒体靶向金属有机框架（T/MOF），实现了对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞膜-胞质-线粒体的级联靶向治疗。该系统通过单原子Pd/Mn2+纳米酶催化ROS爆发、抑制糖酵解/氧化磷酸化（OXPHOS）和诱导免疫原性细胞死亡（ICD），有效克服了TNBC的干细胞异质性和免疫治疗抵抗。

　　

背景

三阴性乳腺癌（TNBC）具有发病早、侵袭性强和治疗靶点缺乏的特点，是最具临床挑战性的乳腺癌亚型。其多层次异质性包括干细胞特性、免疫检查点（IC）上调和代谢可塑性，导致现有治疗策略效果有限。研究团队发现耗竭T细胞来源的细胞外囊泡（EVs）高表达多种IC分子，可作为"诱饵"阻断肿瘤细胞表面配体。TEAD4被鉴定为促进癌症干细胞（CSCs）生长和免疫逃逸的关键基因。

材料与方法

研究团队构建了靶向肿瘤细胞膜-胞质-线粒体级联的新型EV递送系统（siT/MOF@EVs）。该系统通过以下步骤制备：首先制备线粒体靶向的Zn/Mn-MOF（T/MOF），负载单原子Pd纳米酶；然后通过静电吸附将TEAD4-siRNA（siTEAD4）固定在MOF表面；最后用耗竭T细胞来源的EVs进行包封。通过流式细胞术、透射电镜、Western blot等方法验证了EVs的特性；采用共聚焦显微镜观察线粒体靶向效率；通过Seahorse分析仪检测糖酵解和氧化磷酸化水平；建立原位TNBC小鼠模型和患者来源类器官异种移植（PDOX）模型评估治疗效果。

结果与讨论

2.1 耗竭CD8⁺ T细胞来源的EVs发挥诱饵效应介导多重IC阻断

通过αCD3/αCD28抗体联合IL-10刺激成功扩增了耗竭T细胞（PD-1⁺TIM-3⁺比例达71.1%）。提取的EVs平均粒径为115.4±9.3 nm，高表达PD-1、TIM-3和TIGIT。这些EVs能有效阻断肿瘤细胞表面PD-L1、CD155和PtdSer与相应抗体的结合，显著增强CD8⁺ T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（LDH释放增加），并抑制巨噬细胞对凋亡肿瘤细胞的清除。

2.2 siTEAD4/MOF催化持续ROS产生并下调TEAD4杀伤CSCs和非CSCs

TPP修饰的Zn/Mn-MOF（T/MOF）具有典型的纺锤形结构和均匀尺寸，能高效靶向线粒体并诱导ROS爆发。单原子Pd催化O₂转化为H₂O₂，Mn²⁺通过类芬顿反应产生ROS。同时，Zn²⁺抑制HK2蛋白表达阻断糖酵解。生物信息学分析显示TEAD4在TNBC中高表达且与患者不良预后相关，siTEAD4可显著抑制肿瘤细胞迁移侵袭并降低ALDH⁺ CSCs比例。

2.3 siT/MOF@EVs同步抑制TNBC糖酵解/OXPHOS并触发ICD

构建的siT/MOF@EVs粒径为131.47±8.46 nm，siRNA包封率达87.3%。该系统通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，8小时内完成溶酶体逃逸。siT/MOF@EVs处理组肿瘤细胞凋亡率达45.5%，显著高于其他组。Seahorse分析显示其可同时抑制糖酵解（ECAR降低）和OXPHOS（OCR降低），并显著增加免疫原性细胞死亡标志物钙网蛋白（CRT）表达和树突细胞（DCs）成熟比例。

2.4 siT/MOF@EVs在原位TNBC模型中抑制肿瘤生长和自发肺转移

体内分布实验显示Cy7标记的siT/MOF@EVs在肿瘤部位持续富集48小时以上。治疗实验表明其能显著抑制原发肿瘤生长（体积减少70%）和肺转移（结节数减少80%），延长小鼠生存期。流式分析显示肿瘤组织中ALDH⁺ CSCs比例显著降低，YAP/TEAD4下游靶基因CTGF和CYR61表达下调。

2.5 siT/MOF@EVs逆转免疫抑制微环境并诱导保护性免疫记忆

免疫分析显示siT/MOF@EVs治疗组肿瘤浸润CD8⁺ T细胞数量增加2倍，颗粒酶B⁺细胞比例提高3倍，耗竭T细胞（PD-1⁺TIM-3⁺）比例最低。同时显著增加cDC1s数量和M1/M2巨噬细胞比例。肿瘤再攻击实验证实其可诱导CD44^highCD62^low效应记忆T细胞形成，提供长期免疫保护。

2.6 siT/MOF@EVs在人源化PDOX模型中显著抑制肿瘤生长

在患者来源TNBC类器官中，siT/MOF@EVs使肿瘤细胞凋亡率达48.4%，显著高于对照组（15.22%）。PDOX模型治疗显示其可抑制肿瘤生长60%以上，TUNEL染色显示广泛凋亡，Ki-67表达显著下调。所有实验组小鼠体重和肝肾功能指标均正常，显示良好安全性。

结论

该研究构建的多模式siT/MOF@EVs系统通过免疫治疗、基因治疗和化学动力学治疗的协同作用，克服了TNBC异质性挑战。其创新性体现在：1）利用天然EVs作为多重IC阻断剂和靶向载体；2）实现细胞膜-胞质-线粒体的级联靶向；3）通过TEAD4沉默和能量代谢双重干预消除CSCs。这为TNBC的精准治疗提供了新策略。