反向不对称中空纤维膜切向流过滤技术在腺相关病毒2型高效收获中的应用研究

这篇研究深入探讨了采用反向不对称中空纤维膜（BioOptimal? MF-SL）进行切向流过滤（TFF）在腺相关病毒（AAV2）收获中的创新应用。通过临界通量实验和动态压力控制，证明了该技术能在壁剪切率2000 s?1、跨膜压（TMP）3.5 kPa条件下实现94%的病毒回收率，同时有效降低宿主细胞蛋白（HCP）和DNA残留。研究为基因治疗载体规模化生产提供了高效、可放大的解决方案。

　　

1 引言

生物制药生产中的"中游"操作——生物反应器收获（即澄清步骤）面临高细胞密度（>1×10⁸ cells mL^?1）带来的挑战。传统切向流过滤（TFF）因可适配批式和灌流工艺而备受关注。本研究创新性地采用反向不对称中空纤维膜，其开放支撑层面向料液的设计可稳定由颗粒物形成的次级动态膜，该结构兼具深度过滤和精密筛分特性，膜厚仅0.45 mm（内径1.4 mm，外径2.3 mm），显著优于厚壁TFDF（5 mm）膜。

2 材料与方法

实验采用HEK 293细胞生产AAV2，转染72小时后裂解细胞。关键设备包括Asahi Kasei的50 cm² BioOptimal? MF-SL微滤器（5根纤维，孔径0.4 μm）。通过跨膜压（TMP= (P₁+P₂)/2 -P₃）和通量（W×60/ρ×1000×A）实时监测系统，在总循环模式下进行临界通量测定：非转染细胞在壁剪切率100-3000 s^?1时，临界通量从5 Lm^?2h^?1提升至23 Lm^?2h^?1；而AAV2转染细胞因裂解碎片增加（浊度620 NTU vs 240 NTU），临界通量降至15 Lm^?2h^?1。

3 结果

浊度分析显示，次级动态膜在2000 s^?1剪切率下可实现90%浊度去除。AAV收获实验采用3倍透析体积（192 mL PBS），当TMP达3.5 kPa时启动透析，最终获得94%回收率（qPCR检测）。值得注意的是，前三个渗透组分中AAV滴度保持稳定（6.2-6.4×10¹⁰ μg mL^?1），证实次级膜未造成病毒截留。宿主细胞蛋白（HCP）和DNA在渗透液中分别降至0.21 mg mL^?1和1.03 μg mL^?1。

4 讨论

反向不对称膜通过40 μm大孔支撑层稳定次级动态膜，其性能远超传统TFF和交替切向流（ATF）。研究首次证实该技术对含病毒裂解液（含大量亚微米级碎片）的适用性。临界通量概念（Field et al., 1995）在此表现为：超过15 Lm^?2h^?1时TMP急剧上升，这与Bacchin提出的颗粒-膜相互作用理论相符。实际操作建议将TMP控制在临界值50%-80%区间，既可避免膜压实，又能最大化处理量（本实验达756 Lm^?2）。

5 结论

反向不对称膜TFF技术为AAV生产提供了创新解决方案：

1）动态膜形成使通量提升3倍（vs传统TFF）

2）精确的TMP控制（<3.5 kPa）保障次级膜渗透性

3）模块化设计（最大8 m²）支持规模化生产

该技术可延伸应用于其他病毒载体（如慢病毒、疫苗病毒）的连续生产工艺开发。