细菌警报素(p)ppGpp通过双重机制调控密歇根棒状杆菌致病性：影响酶产生与Tat分泌系统的协同作用

（编辑推荐）本研究揭示了细菌警报素(p)ppGpp通过调控细胞壁降解酶（CWDEs）产生和Tat分泌系统的双重机制，驱动密歇根棒状杆菌（Cm）致病性的分子机制。通过转录组分析和生化验证，发现(p)ppGpp通过转录因子Vatr1抑制木聚糖酶基因xysB表达，同时激活Tat系统促进酶分泌，为革兰氏阳性植物病原体的致病机制提供了新见解。

　　

摘要

革兰氏阳性病原菌密歇根棒状杆菌（Clavibacter michiganensis, Cm）引发的番茄细菌性溃疡病对全球农业生产造成重大威胁。本研究聚焦细菌警报素鸟苷四/五磷酸[(p)ppGpp]的调控网络，揭示其通过双重机制——抑制木聚糖酶XysB转录并激活Tat（Twin-arginine translocation）分泌系统——协同调控Cm致病性的创新机制。

引言

Cm依赖Sec和Tat途径分泌细胞壁降解酶（CWDEs），但调控机制尚不明确。前期研究发现(p)ppGpp缺失突变体（Δrel）毒力减弱但定殖能力未受影响，暗示其调控复杂性。本研究通过模拟感染体系（含番茄木质部汁液的mM9培养基），结合RNA-seq和功能验证，系统解析(p)ppGpp的调控靶点。

结果

(p)ppGpp全局调控Cm转录组

Δrel与野生型（WT）比较发现42.93%基因差异表达，涉及核糖体合成、ABC转运蛋白（下调）及氨基酸代谢、生物膜合成（上调）。KEGG分析显示碳代谢和氧化应激通路显著受抑。

毒力因子的双重调控

1. 生物膜与水解酶活性：Δrel生物膜产量减少50%，胞外淀粉酶（水解圈25.5→14.8 mm）和木聚糖酶（6.5→2.2 mm）活性显著降低，但xysB转录反而上调4.06倍。

2. Vatr1介导的xysB抑制：EMSA证实转录因子Vatr1直接结合xysB启动子。微量热泳动（MST）显示ppGpp通过Mg²⁺介导与Vatr1的GLU134/ARG130结合，增强其与DNA亲和力（K_d从18.02降至5.21 nM）。

Tat系统的关键作用

Western blot显示Δrel中XysB在胞内累积（4.06倍），而胞外分泌量仅为WT的26%。大肠杆菌酰胺酶报告实验证实XysB信号肽与Tat系统兼容。Δrel中tatA/B/C表达量下降，导致依赖Tat分泌的木聚糖酶（XysA/XysB/TomA）胞外活性丧失。

讨论

1. 进化适应性：与革兰氏阴性菌不同，Cm的(p)ppGpp不直接影响定殖，而是精细调控毒力效应。

2. 酶活性平衡：XysB的GH10结构域和HYR重复序列赋予其强底物结合力，(p)ppGpp-Vatr1轴可能通过抑制其早期表达避免触发植物防御。

3. 分泌策略：革兰氏阳性菌依赖Tat系统分泌折叠蛋白的独特机制，为靶向干预提供新思路。

方法亮点

• CRISPR/Cas9构建ΔxysB：结合5-FC负筛选实现无标记敲除。

• 多组学验证：RNA-seq与qPCR（gyrB/bipA内参）揭示基因表达动态，EMSA/MST解析蛋白-DNA互作。

• 病理模型：番茄茎秆穿刺接种结合病灶面积量化（ImageJ分析）。

该研究为革兰氏阳性植物病原体的环境适应与致病机制提供了范式，其揭示的(p)ppGpp-Tat调控轴可为抗病靶点设计提供理论依据。