简化基因敲除技术：基于单拷贝质粒的无诱导重组工程在分枝杆菌中的应用

（编辑推荐）本研究创新性地将分枝杆菌重组工程系统（recombineering）的关键基因gp60/gp61置于单拷贝质粒pDB539的组成型启动子MOP下，成功消除了传统pJV53系统需乙酰胺诱导和培养基更换的繁琐步骤，显著提升了Mycobacterium tuberculosis（Mtb）、M. marinum和M. abscessus的基因删除效率，为结核病等病原菌研究提供普适性工具。

　　

ABSTRACT

基因删除是细菌表型研究的重要工具，但在分枝杆菌中构建缺失突变体仍面临耗时长、成功率低的难题。研究团队对广泛使用的重组工程技术进行改良，通过将重组促进蛋白基因gp60-61整合至单拷贝附加体质粒，利用组成型启动子实现持续表达，不仅省去电穿孔前的诱导步骤，还大幅缩短后续质粒消除周期。该方法在结核分枝杆菌、海分枝杆菌和脓肿分枝杆菌中均验证有效。

IMPORTANCE

传统分枝杆菌基因删除技术对分子生物学专业度要求较高。本研究提出的改良方案通过简化操作流程，使全球更多实验室（包括分子生物学基础薄弱者）能够开展分枝杆菌遗传操作。

INTRODUCTION

靶向基因删除在分枝杆菌研究中面临特殊挑战：经典的双步等位基因交换法效率低下，温度敏感噬菌体系统和ORBIT系统则步骤繁琐。2007年报道的pJV53系统虽被广泛采用，但其依赖乙酰胺诱导的特性导致细菌存活率下降，且需将含葡萄糖的oADC培养基替换为琥珀酸盐培养基。此外，结核分枝杆菌对质粒的顽固保留特性使得pJV53消除过程异常漫长。

Overview of proposed tweak

研究团队从pJV53扩增gp60-61基因，将其连接至含MF1复制子的穿梭载体。该源自^{M. fortuitum}的单拷贝质粒具有两大优势：无需诱导即可维持重组酶表达，且在撤除选择压力后能快速自发丢失。新构建的pDB539质粒保留了卡那霉素抗性标记，其电转化效率与常规方法相当。

RESULTS

Deletion of the small RNA B11 from ^{M. abscessus}

使用zeocin抗性标记构建的靶向底物（两侧同源臂分别为1.7kb/1.8kb）电转化后，37个菌落均呈现特征性粗糙形态，PCR验证5个随机菌株均显示正确重组。值得注意的是，30个单克隆在传代后全部自发丢失pDB539，证明MF1复制子的不稳定特性。

Deletion of mmar_3011-4 from ^{M. marinummoffett}

海分枝杆菌的基因删除常伴随高频非法重组。采用潮霉素抗性系统（同源臂1.0kb/0.9kb）时，9个菌落中有7个通过PCR验证为正确缺失突变体。与脓肿分枝杆菌类似，30个单克隆全部在无选择压力下丢失质粒。

Deletion of rv0275 from ^{M. tuberculosis H37Ra}

在结核分枝杆菌中，传统pJV53系统曾导致全为非法重组体。改用pDB539系统后，zeocin抗性底物（同源臂720bp/700bp）产生数十个菌落，随机检测10个均为正确缺失突变体。16个单克隆全部在3周内自发清除质粒，克服了结核菌顽固保留质粒的难题。

DISCUSSION

Selection marker choice

不同分枝杆菌对抗生素敏感性差异显著：脓肿分枝杆菌对zeocin（50-66μg/mL）敏感但需超高浓度潮霉素（1000-2000μg/mL）；海分枝杆菌适用50μg/mL潮霉素；结核分枝杆菌中zeocin（25μg/mL）与潮霉素（50μg/mL）均有效。

Electroporation procedure

添加双辛胺（20-40μM）可抑制分枝杆菌酸环丙烷化，可能提升电转化效率。建议每次实验设置阳性（含相同抗性质粒）和阴性（含无关抗性质粒）对照板监控转化效率。

Overall success

该方法并非万能：结核分枝杆菌rv2038-41的两次删除尝试均告失败，而rv2686-88c（推测的环丙沙星外排泵）则成功获得6个正确突变体。研究者强调转化效率的批次差异是影响成功率的关键因素，建议优先选择转化效率>10⁶ CFU/μg的批次开展实验。

MATERIALS AND METHODS

实验菌株均采用7H9基础培养基，添加甘油和吐温80（液体培养基）或15g/L琼脂（固体培养基）。电转化前用10%甘油洗涤菌体，脓肿分枝杆菌需保持低温操作。抗生素使用浓度根据菌种调整：大肠杆菌zeocin 33μg/mL，脓肿分枝杆菌卡那霉素240μg/mL，结核分枝杆菌卡那霉素20μg/mL。

ACKNOWLEDGMENTS

以色列科学基金会（ISF 608/22）为本研究提供资助。研究者承诺向学术界免费提供pDB539质粒。