猪繁殖与呼吸综合征病毒2型减毒活疫苗中nsp2复制酶介导的病毒脱壳机制及其免疫保护作用研究

【编辑推荐】本研究首次揭示PRRSV-2减毒活疫苗(LAV)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制缺陷源于nsp2介导的病毒脱壳障碍，通过构建nsp2嵌合病毒证实其可显著减弱高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒力并保留免疫原性，为PRRSV疫苗的理性设计提供了新策略。

　　

PRRSV-2减毒活疫苗的复制缺陷机制

ABSTRACT

猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV-2)是全球养猪业的重大威胁。虽然减毒活疫苗(LAV)是最有效的防控手段，但其减毒分子机制尚未阐明。研究发现PRRSV-2 LAV在主要靶细胞——猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中表现出复制受损，而病毒脱壳缺陷是关键的复制障碍。非结构蛋白2(nsp2)被鉴定为调控该减毒表型的关键病毒决定因子。引人注目的是，将疫苗株nsp2替换至高致病性PRRSV(HP-PRRSV)可显著减弱仔猪毒力同时保持免疫原性，嵌合病毒能诱导针对HP-PRRSV攻击的强效保护性免疫。

IMPORTANCE

LAV是防控PRRSV感染的主要手段，但PRRSV减毒机制认知有限。研究发现商业PRRSV LAV在PAMs中无法完成脱壳，阐明了新型减毒机制。特别鉴定出病毒粒子蛋白nsp2是PRRSV减毒的关键因素，证实用LAV来源的nsp2编码区替换可快速获得减毒株并提供有效保护。

INTRODUCTION

LAV是应对病毒性疾病最成功的工具，传统LAV通过细胞传代或宿主适应获得减毒性，但多数LAV的精确减毒机制仍不清楚。PRRSV主要感染单核-巨噬细胞系，中国作为最大生猪生产国，PRRSV-2流行造成巨大经济损失。商业PRRSV LAV通过Marc-145细胞连续传代获得，如CH-1R株经160代传代培育。

nsp2作为PRRSV最大的复制酶，具有多种功能：包含五个结构域，N端含半胱氨酸蛋白酶结构域(CP)，可变区调控病毒mRNA合成，参与炎症调节和天然免疫应答，调控细胞自噬与凋亡。已鉴定出nsp2三种亚型：全长nsp2、nsp2TF和nsp2N，均对抑制宿主免疫应答至关重要。

RESULTS

PRRSV-2商业LAV在PAMs中复制失败

比较五种商业LAV(CH-1R、F112、JXA1-R、GDr180、Ingelvac PRRS MLV)与HP-PRRSV HuN4株的复制能力。所有疫苗株在Marc-145细胞中高效复制，但在PAMs中仅HuN4显示高效复制，LAVs感染细胞数量显著减少。复制动力学实验证实LAVs在PAMs中的复制受限。

减毒PRRSV疫苗可附着并进入PAMs

使用CH-1R和F112为代表株，发现其与HuN4类似能结合PAMs表面并内化至胞质。共聚焦显微镜显示病毒与早期内体标志物Rab5共定位，但不进入晚期内体(Rab7)或溶酶体(Lamp1)，表明LAVs能完成初期感染步骤。

PAMs在病毒蛋白/RNA合成前限制CH-1R和F112

感染12小时后，HuN4组多数细胞检测到dsRNA信号，而LAVs组仅零星阳性。转染实验表明，当绕过病毒进入步骤时，CH-1R能在iPAM细胞中表达N蛋白，证实限制发生在脱壳后、RNA合成前阶段。

PAMs限制LAV感染于脱壳步骤

采用DiD标记病毒粒子实时监测膜融合过程。在Marc-145细胞中，HuN4、CH-1R和F112均显示随时间增强的DiD荧光；而在PAMs中仅HuN4出现显著信号，证实LAVs在PAMs中存在脱壳缺陷。

nsp2基因参与PAMs中的病毒脱壳

构建结构基因(GP2-M)和nsp2的嵌合病毒。发现替换nsp2显著影响病毒嗜性：将HuN4的nsp2替换为CH-1R来源(nsp2)的HC-nsp2株在PAMs中复制受阻，而反向嵌合体CH-nsp2则部分恢复复制能力。DiD实验显示CH-nsp2在PAMs中的融合信号强于亲本CH-1R，但弱于HuN4。

嵌合病毒HC-nsp2对仔猪的致病性减弱

动物实验显示：HuN4感染组出现持续高热(>40.5°C达6天)、严重呼吸道症状和3例死亡；而HC-nsp2组无临床症状，体重增长正常。组织病毒载量检测显示HC-nsp2在心、肺、淋巴结等器官的复制水平显著低于HuN4。

HC-nsp2免疫提供抗HuN4攻击的保护

攻毒实验证实，HC-nsp2免疫组在HuN4攻击后无发热或病理损伤，肺部病变评分显著降低，血清病毒载量比攻毒对照组低100倍以上，显示完全临床保护。

DISCUSSION

该研究首次阐明PRRSV LAVs的减毒与PAMs中nsp2介导的脱壳障碍直接相关。不同于既往认为结构蛋白决定嗜性的观点，发现nsp2这一病毒粒子相关蛋白是关键减毒决定因子。虽然nsp2序列差异导致154个氨基酸突变，但单个基因替换即可实现毒力显著减弱，这为快速开发针对新发PRRSV毒株的疫苗提供了概念验证。未来需解析nsp2具体功能域及其与CD163等宿主因子的互作机制，以优化疫苗设计策略。

MATERIALS AND METHODS

实验采用Marc-145细胞和原代PAMs培养系统，通过免疫荧光(IFA)、病毒滴定(TCID₅₀)、DiD标记活细胞成像等技术分析病毒复制。构建嵌合病毒时，利用HuN4和CH-1R感染性克隆进行基因替换。动物实验选用28日龄SPF仔猪，通过体温监测、临床评分、组织病理学和qPCR评估毒力和免疫效果。