单链DNA断裂精准定位新方法：基于序列模板的错误DNA聚合酶末端标记测序技术(STEEL-seq)

为解决单链DNA断裂(SSBs)检测精度不足的问题，研究人员开发了序列模板错误末端标记测序技术(STEEL-seq)。通过工程化改造的高错误率DNA聚合酶"Sloppymerase"，在缺失特定核苷酸条件下实现对SSBs的精准定位，测得人类基因组SSBs频率为0.7-3.8×10-6，并发现其在活性启动子区域富集。该技术兼容多种测序平台，为DNA损伤研究提供了新工具。

　　

在生命活动中，DNA时刻面临着内源性代谢产物（如活性氧）和外源性因素（如辐射）的威胁，导致化学修饰或链断裂等损伤。其中单链DNA断裂(SSBs)是最常见的损伤类型，每个细胞每秒产生1-10个SSBs。虽然不如双链断裂(DSBs)严重，但SSBs修复过程中的错误可能引发突变，甚至被B细胞利用于抗体亲和力成熟。然而，现有SSBs检测方法存在明显局限：COMET实验等传统技术缺乏单碱基分辨率；基于3'-OH末端标记的方法无法区分SSBs和DSBs；而测序前必需的DNA片段化步骤会人为引入断裂。这些技术瓶颈严重阻碍了对SSBs形成机制及其生物学功能的深入理解。

针对这一挑战，来自瑞典乌普萨拉大学(Uppsala University)的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性解决方案。研究人员另辟蹊径，设想利用特殊DNA聚合酶在SSBs位点引入独特的"分子指纹"——当聚合酶在缺失特定核苷酸（如dATP）条件下延伸时，会在模板链胸腺嘧啶(T)对应位置强制引入错配碱基。这种"错误标记"模式与侧翼序列信息相结合，可实现对SSBs的精准识别。为实现这一设想，研究团队成功构建了嵌合DNA聚合酶"Sloppymerase"，它融合了酿酒酵母DNA聚合酶η的催化域和大肠杆菌DNA聚合酶I的5'-3'核酸酶域，具有低保真度、高错配延伸能力和链置换活性等独特性质。

研究采用多组学技术联用策略：通过蛋白质工程构建Sloppymerase并验证其功能特性；利用Sanger、Illumina、PacBio和Nanopore四种测序平台验证STEEL-seq技术的普适性；结合转录组分析揭示SSBs与基因表达的关联。实验样本包括TK6淋巴母细胞和HaCaT角质形成细胞系，并应用TGFβ刺激和RNA聚合酶抑制剂BMH-21处理建立基因表达调控模型。

研究结果首先证实了Sloppymerase的独特性能。如图2所示，这种工程化聚合酶在缺失dATP时仍保持延伸活性，且主要用鸟嘌呤(G)替代腺嘌呤(A)，呈现明显的"嘌呤替代嘌呤"偏好性。Illumina测序数据显示，Sloppymerase处理的DNA产生79%独特序列变异，远高于四核苷酸完整时的52%，证实其可产生高度特异的分子标签。

STEEL-seq技术的核心优势在图4中得到充分展示。通过比较Nt.BsmAI核酸酶处理的样本与对照，研究人员证实该方法可精确定位线粒体DNA(chrM)上13020和14960位点的SSBs，且信号在所有测序平台中一致出现。定量分析显示，人类基因组SSBs频率为0.7-3.8×10^-6，与大肠杆菌中报道的1.2×10^-6相当。特别值得注意的是，如表1所示，73%的检测信号与预设的核酸酶靶位点重合，而随机对照仅有5-7%的重合率，证明方法具有高度特异性。

更深入的机制研究发现，SSBs在基因组中呈非随机分布。如图5所示，启动子区和5'UTR的SSBs密度显著高于其他区域，且这种富集在活跃转录基因中更为明显。TGFβ刺激可诱导靶基因（如SERPINE1、IL11等）表达上调，同时使这些基因启动子区SSBs频率从2.4×10^-6升至4.1×10^-6。而RNA聚合酶抑制剂BMH-21能部分抑制这种增加，暗示转录过程与SSBs形成存在直接关联。

这项研究在方法学和生物学机制层面均取得重要突破。技术方面，STEEL-seq首次实现对SSBs的单碱基精度定位，且无需DNA片段化预处理，避免了人为引入断裂的问题。生物学意义上，发现SSBs在活跃基因启动子区的特异性富集，为理解转录起始的分子机制提供了新视角。研究人员推测，转录因子结合可能引起DNA构象变化，招募XPG/XPF等核酸酶产生SSBs，这些断裂或许通过改变局部拓扑结构促进转录起始复合体的组装。

该技术未来可进一步拓展应用：通过组合不同核苷酸缺失方案，有望实现多种DNA损伤（如8-氧代鸟嘌呤）的同时检测；在固定细胞中应用可能推动单细胞水平SSBs研究。这些发展将为癌症基因组不稳定性和基因表达调控领域带来新的研究工具和理论框架。正如作者所言："我们本质上开发了有史以来最差的DNA聚合酶"，正是这种"反其道而行"的创新思维，为解决长期困扰领域的检测难题提供了巧妙方案。