解脂耶氏酵母中整合蛋白与代谢工程实现白藜芦醇衍生物的高效生物合成

研究人员针对白藜芦醇衍生物（如紫檀芪和紫檀茋）传统生产方法效率低、成本高的问题，通过整合蛋白与代谢工程策略，在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中构建了高效生物合成平台。通过优化异源途径、关键酶定向进化及辅因子调控，实现了紫檀芪（342.1 mg/L）和紫檀茋（179.4 mg/L）的创纪录产量，为规模化生产高价值芪类化合物提供了新思路。

　　

白藜芦醇衍生物紫檀芪（piceatannol）和紫檀茋（pterostilbene）因其卓越的药理活性（如抗癌、抗糖尿病和神经保护作用）备受关注，但传统植物提取法效率低下，化学合成则面临立体构型控制难、毒性副产物等问题。尽管微生物合成取得进展，但现有体系（如大肠杆菌和酿酒酵母）存在丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）和辅因子供应不足的瓶颈。为此，湖北大学生命科学学院工业生物技术湖北省重点实验室的研究团队选择非传统产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为宿主，通过整合蛋白与代谢工程技术，成功构建了直接从葡萄糖合成这两种高价值化合物的高效平台，相关成果发表在《Systematic and Applied Microbiology》。

研究团队首先通过CRISPR-Cas9系统在解脂耶氏酵母中引入优化的异源途径（FjTAL/At4CL1/VvVST1），并结合关键内源基因（ylTYR1/ylHIS5）过表达，获得高产白藜芦醇的底盘菌株（526.0 mg/L）。随后，分别引入来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的HpaBC单加氧酶和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT），实现紫檀芪（273.1 mg/L）和紫檀茋（61.8 mg/L）的从头合成。通过HpaBC基因拷贝数倍增和核黄素转运蛋白（MCH5）过表达，紫檀芪产量提升25.3%；而对COMT进行定向进化获得六点突变体（H164Q/T308N/V311I/A160V/H321L/N322F）并结合多拷贝染色体整合，使紫檀茋产量提高190.3%。

关键实验技术

1. CRISPR-Cas9基因组编辑：用于精准整合异源基因和调控内源代谢通路；
2. 定向进化：通过易错PCR构建COMT突变体库，结合生长耦合筛选获得高效突变体；
3. 分子对接与结构模拟：采用AlphaFold3和YASARA分析突变体活性位点变化；
4. 多拷贝染色体整合：通过多位点基因插入增强限速酶表达；
5. 辅因子工程：过表达FADH₂合成相关基因（RIB1/FLX1/MCH5）优化电子传递链。

研究结果

1. 羟基化与甲基化途径验证：在解脂耶氏酵母中证实HpaBC和COMT的催化活性，分别实现311.3 mg/L紫檀芪和94.1 mg/L紫檀茋的转化效率。
2. 白藜芦醇高产菌株构建：通过强化莽草酸途径（DHS1/ylARO4^K221L/aroG^G146N）和引入异源合成模块（FjTAL/At4CL1/VvVST1），白藜芦醇产量达543.7 mg/L。
3. 紫檀芪产量提升：双拷贝HpaBC与MCH5过表达使紫檀芪产量提高至342.1 mg/L，且未检测到中间产物咖啡酸积累。
4. COMT突变体优化：突变体S3的k_cat值提升6.7倍，结合七拷贝整合使紫檀茋产量达179.4 mg/L，为目前微生物合成最高水平。

结论与意义
该研究首次在解脂耶氏酵母中建立了紫檀芪和紫檀茋的从头合成体系，产量远超既往报道的酿酒酵母和大肠杆菌系统。通过蛋白工程（如COMT定向进化）与代谢工程（如辅因子调控）的协同优化，解决了羟基化和甲基化效率低的核心瓶颈。这一工作不仅为规模化生产高活性芪类化合物提供了新策略，也彰显了解脂耶氏酵母在合成复杂天然产物中的独特优势，为其他高价值植物次生代谢物的微生物制造提供了范式。