马克斯克鲁维酵母代谢工程与适应性实验室进化在乳酸生产中的应用研究

本研究针对生物基乳酸(LA)生产过程中中和剂用量大、底物成本高等问题，通过整合马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)天然多样性筛选、CRISPR/Cas9基因编辑和适应性实验室进化(ALE)技术，成功构建了耐受低pH和高乳酸浓度的工程菌株Km3eng,SUA7*，其乳酸产量达120 g L-1，转化率0.81 g g-1，且能高效利用木糖等廉价底物。该研究为可持续生物塑料聚乳酸(PLA)生产提供了新型微生物工厂。

　　

随着全球每年4.14亿吨塑料的生产，99%依赖化石原料的现状亟待改变。聚乳酸(PLA)作为最具潜力的生物塑料，其原料乳酸(LA)90%通过微生物发酵生产，但现有乳酸菌(LAB)工艺存在需大量中和剂(pH 7.0)、营养需求复杂等问题。VIB-KU Leuven Center for Microbiology的研究团队另辟蹊径，选择耐酸、生长快速(倍增时间0.75 h^-1)且能天然利用木糖的非传统酵母马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)作为底盘细胞，通过多组学联用技术开发出性能超越细菌的乳酸生产系统。

研究采用三大关键技术：(1)高通量表型筛选168株K. marxianus，选出10株耐酸(生长pH 3-8)且能利用木糖的野生型；(2)CRISPR/Cas9基因编辑敲除PDC1(丙酮酸脱羧酶)和CYB2(细胞色素b2)，引入植物乳杆菌LpLDH(乳酸脱氢酶)；(3)适应性进化(ALE)提升菌株乳酸耐受性，结合全基因组测序鉴定关键突变。

结果部分

High-throughput screening reveals phenotypic diversity

筛选发现墨西哥龙舌兰发酵来源的菌株Km3在50 g L^-1乳酸和pH 2.5下仍能生长，其木糖利用率比参考菌株NBRC 1777高30%。

Genetic engineering enables LA production

PDC1敲除和LpLDH引入使Km3初始乳酸产量达14.8 g L^-1，CYB2敲除进一步提升产量至0.68 g g_glucose^-1，且乙酸副产物减少40%。

Adaptive laboratory evolution improved performance

ALE获得突变株Km3eng,SUA7*，其转录因子SUA7第279位丝氨酸突变为脯氨酸(S279P)，使生物量在乳酸压力下提升13.5倍，乳酸产量增加18%，且能耐受10 g L^-1乙酸。

Fed-batch fermentation reaches industrial titers

在pH 6.0的0.5 L生物反应器中，Km3eng,SUA7*实现120 g L^-1乳酸浓度和1.44 g L^-1 h^-1的生产率，中和剂用量比细菌工艺减少50%。

结论与意义

该研究首次揭示SUA7转录因子突变通过调控氧化应激通路增强有机酸耐受性的机制，创制的工程菌株兼具高产(120 g L^-1)、高转化率(0.81 g g^-1)和低营养需求(酵母提取物5 g L^-1)三大优势。相比传统细菌工艺，该体系可降低中和成本60%，且能直接利用木质纤维素水解液，为第二代PLA生物塑料的可持续生产提供了全新解决方案。论文发表于《Microbial Cell Factories》，为"非模式微生物+合成生物学"的组合策略提供了典范。