基于dSTORM超分辨显微镜技术实现原发性人类T细胞嵌合抗原受体的直接可视化研究

这篇研究开创性地运用直接随机光学重构显微镜(dSTORM)技术，通过靶向IgG4的F(ab)2片段实现了对嵌合抗原受体(CAR)在原发性人类T细胞表面表达的单分子水平检测。该技术突破了传统流式细胞术的灵敏度限制，首次实现了不依赖CAR特异性的通用型检测，为解析CAR-T细胞表面受体空间组织、评估产品效力及安全性提供了革命性工具。研究揭示了CAR表达水平受T细胞亚型(CD4+/CD8+)、供体来源和CAR构建特征的显著影响，并发现SLAMF7 CAR-T细胞具有独特的激活表型特征。

　　

1 引言

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已成为血液系统恶性肿瘤的突破性治疗手段，其通过MHC非依赖方式识别表面抗原的特性，使得靶向杀伤肿瘤细胞成为可能。目前FDA和EMA已批准7种CAR-T产品，但实体瘤治疗仍面临细胞持久性不足、靶向迁移效率低等挑战。CAR作为细胞表面关键信号枢纽，其表达水平和空间分布直接决定T细胞活化强度，其中包含scFv抗原结合区、IgG4衍生铰链区及CD3ζ/共刺激域(如CD28或4-1BB)的第二代CAR最为常用。传统检测方法如流式细胞术依赖转导标记物(如EGFRt)或抗原特异性抗体，存在表达量评估偏差大、成本高等局限。

2 方法

研究团队构建了靶向SLAMF7、BCMA和CD19的二代CAR载体，通过慢病毒转导健康供体PBMCs制备CAR-T细胞。创新性地采用抗IgG4 F(ab')₂-Alexa Fluor 647偶联物进行标记，在优化浓度10μg/ml下实现特异性结合。dSTORM成像使用640nm激光激发，通过15,000帧图像采集(20ms/帧)达到约20nm定位精度。数据分析采用DBSCAN聚类算法(ε=20nm，MinPts=3)定量膜表面CAR密度，同时通过流式细胞术评估T细胞表型及细胞毒性功能。

3 结果

超分辨成像揭示：CD8⁺ T细胞的CAR表达量(0.98±0.07簇/μm²)显著高于CD4⁺亚群(0.69±0.04)。不同CAR构建间存在明显差异，SLAMF7 CAR表达最高(CD8⁺达1.56±0.12)，而缺失CH2CH3结构域的CD19 CAR表达最低(0.31±0.03)。供体间变异分析显示，相同CAR在供体1的表达量(0.92±0.05)显著高于供体2(0.66±0.06)。功能验证发现所有CAR-T细胞均具特异性杀伤能力，其中SLAMF7 CAR-T细胞表现出独特的基线激活特征(CD25⁺CD69⁺双阳性率升高)和干细胞样记忆表型(T_SCM)扩增，可能与SLAMF7自识别引发的持续性激活有关。

4 讨论

该研究建立的dSTORM检测平台具有三大突破性优势：①单分子灵敏度可检测低至0.1簇/μm²的CAR表达；②通用型IgG4靶向策略适用于85%临床阶段CAR产品；③纳米级分辨率可解析CAR膜分布模式。特别值得注意的是，传统流式检测会高估CD19 CAR表达量(EGFRt MFI=15800)，而dSTORM揭示其实际表面密度仅为SLAMF7 CAR的1/5，这种差异可能源于CH2CH3结构域缺失导致的抗体结合效率降低。研究为CAR-T产品优化提供了关键质量参数，未来可结合抗原密度定量，建立"CAR-靶标表达阈值"模型指导临床方案设计。

5 应用前景

该技术平台在以下领域具重大应用价值：①评估不同代次CAR(如含ICOS或OX40的三代CAR)的膜组织特征；②解析靶抗原密度与CAR簇形成的关系；③监测治疗过程中CAR表达动态变化。近期已有研究利用类似技术发现CD19抗原呈"纳米簇"分布可增强CAR信号，提示超分辨成像将推动"智能CAR"设计新时代的到来。