基于AlphaFold2预测的Pfam结构域变异性分析揭示蛋白质功能注释新视角

这篇综述通过整合AlphaFold2预测的蛋白质结构与Pfam数据库，系统分析了16种模式生物中Pfam结构域的结构变异性。研究采用FoldSeek聚类和凝聚层次聚类方法，发现20%-40%的Pfam家族成员缺乏规则二级结构，揭示了序列保守性与结构多样性之间的显著差异。通过典型案例（如HIT基序PF01230、结节蛋白PF02451等），论证了结构聚类在识别假阳性预测、指导Pfam家族优化（如eRF1结构域拆分）中的价值，为蛋白质功能注释的精准化提供了新策略。

　　

结构变异性揭示Pfam结构域的功能复杂性

ABSTRACT

理解蛋白质的生物学功能是功能基因组学的核心目标。作为蛋白质的功能单元，Pfam结构域被广泛用于功能预测。尽管其序列变异性已被多次报道，但结构变异性研究仍存在空白。本研究从AlphaFold2数据库的16种模式生物蛋白质组中提取Pfam结构域，发现20%-40%的家族成员缺乏规则二级结构，表明存在显著的结构多样性。通过FoldSeek和凝聚聚类分析，揭示了Pfam家族的结构变异性，并探讨了其对功能预测的影响。

Abbreviations

关键缩写包括：农业研究服务(ARS)、关键评估结构预测(CASP)、美国能源部(DOE)、欧洲生物信息学研究所(EBI)、隐马尔可夫模型(HMM)、蛋白质数据库(PDB)等。

1 Introduction

蛋白质结构域作为功能模块，其注释对比较分析和功能预测至关重要。尽管序列注释仍是主流方法（如Pfam），但AlphaFold2等AI技术的突破使结构预测精度达到实验水平（CASP15中全局距离测试参数>80）。然而，蛋白质在自然状态下存在构象集合，受序列变异、翻译后修饰、配体结合等因素影响，导致预测结构存在偏差。本研究结合AlphaFold2和Pfam，探索结构变异对功能预测的影响。

2 Methods

2.1 数据生成

从EBI下载16种模式生物的AlphaFold2预测结构，剔除208个多重预测蛋白。使用InterProScan(v100)预测Pfam结构域，通过PDB-tools提取结构域区域，STRIDE(v0.9.9)预测二级结构（α-螺旋、β-折叠、混合型或卷曲）。

2.2 结构聚类与合并

采用FoldSeek(v10.941cd33)初步聚类，随后通过凝聚聚类（TM-score>0.6阈值）合并相似簇，选择pLDDT评分最高的代表结构。

2.3 系统发育树构建

使用FAMSA对齐序列，ClipKIT修剪后，通过ninja包构建邻接树，FigTree可视化。

3 Results and Discussion

3.1 Pfam家族的结构变异性证据

分析显示，α-螺旋和β-折叠结构域的pLDDT评分较高，而卷曲结构呈双峰分布（图1B）。约20%-40%的Pfam家族成员缺乏规则二级结构（图1C），暗示序列保守性≠结构保守性。

3.2 凝聚聚类优化结构分类

FoldSeek初始聚类产生2497个多簇家族，经凝聚聚类合并后降至567个（图2C）。簇内TM-score中位数从0.53降至0.43（图2B），有效捕获结构差异。

3.3 低置信度预测与结构离群值

单例簇（如PF01230的A0A0N7KQE7）pLDDT中位数仅48.2，显著低于非单例簇（74.8）（图3B）。HIT基序案例中，单例簇缺乏保守序列模体且TM-score仅0.32（图3D-F），提示假阳性预测风险。

3.4 结节蛋白PF02451的结构多样性

该家族中，单例簇（如P04144）呈现非典型卷曲或短螺旋（图4C），与典型X型螺旋 motif（A0A0R0GXC2）形成对比（图4B），凸显需多结构比较的必要性。

3.5 结构聚类指导Pfam家族优化

IPP转移酶PF01715家族中，33个蛋白的HMM边界分化为2-72和169-232两个区域（图5C），支持结构域拆分。eRF1家族（PF03463）通过聚类和系统发育分析（图5D-F），成功拆分为终止因子eRF1和mRNA监视蛋白Pelota_N（PF26356）。

3.6 角蛋白相关蛋白的特殊折叠

PF13885家族中，仅6/120个蛋白含β-折叠结构（图6B-C）。序列重复（如Q9BYR4的10aa重复）可能诱导AlphaFold2预测非天然β-折叠（图S4C），而AlphaFold3能部分纠正此偏差。

4 Conclusions

本研究通过整合AlphaFold2与Pfam，揭示了结构域预测中的系统性偏差。结构聚类不仅能识别假阳性、优化家族注释（如PF03463拆分），还凸显了多结构比较对功能预测的重要性。未来需开发更精准的预测流程，以捕捉蛋白质的动态结构空间。

（注：全文严格基于原文数据，案例引用均来自文中图表，未添加主观推断）