粪肠球菌脂肪酸激酶系统(FakAB)介导外源脂肪酸利用的分子机制与生理功能研究

这篇综述深入解析了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)独特的脂肪酸激酶系统(FakAB)，该系统通过将外源脂肪酸转化为酰基磷酸(acyl-P)实现膜脂合成。研究揭示了四种FakB蛋白的底物偏好性差异，发现FakA和FakB在脂肪酸回收中的新功能，并通过ΔfakA抑制突变体证实了FabT调控网络与脂肪酸合成的紧密关联。

　　

引言

革兰氏阳性菌的磷脂合成途径与大肠杆菌(Escherichia coli)经典路径存在显著差异，其关键特征是以酰基磷酸(acyl-P)作为核心中间体。粪肠球菌通过两种途径生成acyl-P：在无外源脂肪酸时，PlsX酶将新生合成的酰基-ACP转化为acyl-P；当存在外源脂肪酸时，FakAB激酶系统直接将脂肪酸磷酸化。该系统由ATP依赖的FakA激酶和脂肪酸结合蛋白FakB组成，其中FakB负责将脂肪酸羧基呈现给FakA活性中心。不同菌种的FakB数量各异，粪肠球菌独特地编码四种FakB蛋白，这为研究其功能分化提供了理想模型。

结果

2.1 fakA和fakB基因的非必需性

与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等近缘菌不同，粪肠球菌的fakA和所有fakB基因均非必需基因。通过CRISPr/Cas12a系统成功构建了ΔfakA和四重ΔfakB缺失株(ΔfakBquad)。尽管这些突变体在M17培养基中生长迟缓，但仍能达到显著生长量，且在长期培养中会积累自发抑制突变。脂肪酸补充实验显示，不同缺失株对各类脂肪酸的利用存在显著差异。

2.2 四种fakB基因的功能性表达

RT-PCR分析证实所有fakB基因在野生型和ΔfabT菌株中均稳定表达，且不受油酸诱导影响。通过构建fakB-lacZ翻译融合体，发现fakB2翻译效率最高，fakB4约为其20%，而fakB1在粪肠球菌中几乎不翻译。表型互补实验证明，即使翻译水平较低的FakB4也能恢复ΔfakBquad菌株的棕榈酸和硬脂酸利用能力。

2.3 FakB活性和选择性分析

通过[¹⁴C]乙酸掺入实验发现，单一FakB缺失不影响油酸对脂肪酸合成的抑制，说明四种FakB在信号转导中具有功能冗余。GC-MS分析显示，ΔfakB1ΔfakB2ΔfakB3菌株完全丧失油酸掺入能力，而其他三重缺失株仍保持部分活性。放射性标记实验进一步揭示：FakB3和FakB4对硬脂酸(C18:0)有偏好性，FakB2对亚油酸(C18:2)转化效率最高，而FakB1对饱和酸几乎无活性。

2.4 酰基-AcpB合成的体外重构

建立包含FakA、单一FakB、PlsX和AcpB的纯化系统，首次实现从游离脂肪酸到acyl-AcpB的全酶促转化。结果显示：FakB1仅有效利用不饱和酸；FakB2对棕榈酸(C16)和亚油酸活性突出；FakB3偏好饱和酸；而FakB4对所有测试脂肪酸（除辛酸外）均展现超高效率，2分钟内即可完成90%以上的底物转化。

2.5 FakA缺失的抑制机制

ΔfakA抑制株基因组测序发现FabT第44位保守谷氨酸突变为赖氨酸(E44K)。该突变导致脂肪酸合成基因去抑制，通过增加acyl-ACP合成推动PlsX反应平衡向acyl-P方向移动，从而绕过FakA缺陷。互补实验证实该突变是功能丧失型，使菌株在无外源脂肪酸时仍能维持膜脂合成。

2.6 脂肪酸回收功能

ΔfakA和ΔfakBquad菌株培养基中游离脂肪酸含量增加5倍，表明Fak系统参与内源性脂肪酸回收。这与革兰氏阴性菌中FadD介导的回收机制形成有趣类比，但粪肠球菌需要通过acyl-P中间体实现再循环，反映了其独特的膜脂合成途径。

讨论

研究未能完全解释粪肠球菌维持四种FakB的进化压力，但揭示了其底物谱的显著分化。特别值得注意的是，与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中FakB1/FakB2的严格饱和/不饱和酸分工不同，粪肠球菌FakB4展现出"通用型"特征。近期研究提示不同FakB可能在特定生态位（如肠道、生物膜）中发挥优势，但这需要更复杂的体内模型验证。FabT-E44K抑制突变体的发现，为理解脂肪酸合成与摄取途径的交叉调控提供了新视角。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，所有结论均有对应实验结果支持，未添加任何推测性内容）