口腔细菌葡聚糖蔗糖酶中葡聚糖结合域的功能角色与折叠特性研究

这篇研究深入探讨了链球菌葡聚糖蔗糖酶（GTF-I）中葡聚糖结合域（GBd）的结构与功能关系。通过构建系列缺失突变体和环形置换蛋白，揭示了GBd前四个串联重复序列及正确域取向对高效葡糖基转移的关键作用。研究结合圆二色谱（CD）和热解折叠分析，首次提出葡糖基转移效率与域间协同折叠（interdomain allostery）密切相关，为优化葡聚糖蔗糖酶功能及抑制细菌生物膜形成提供了新靶点。

　　

摘要

研究聚焦于变形链球菌（Streptococcus sobrinus）葡聚糖蔗糖酶（GTF-I）的葡聚糖结合域（GBd），该酶通过催化α-1,3-糖苷键延伸葡聚糖链，其活性受引物葡聚糖增强。GBd包含六个串联重复序列，研究通过构建七种缺失突变体和一种环形置换蛋白（DCP），系统评估了GBd对酶活性、葡聚糖结合及结构稳定性的影响。

材料与方法

采用同源建模技术，基于乳酸杆菌GTF-180晶体结构（PDB ID: 3KLK和4AYG）构建了GTF-I的直链和弯曲构象模型。通过PCR和酶切技术构建了包括GSdGBd2R（仅含前两个重复序列）、GSdGBd4RS/RL（不同长度四重复序列）、ΔNGBd（缺失N端GBd）及DCP（域间环形置换）等突变体。蛋白质通过DEAE-650M柱层析纯化，酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸法，结合等温滴定量热法（ITC）和圆二色谱（CD）分析结构特性。

结果

酶活性：GSdGBd6R（完整GBd）的葡糖基转移活性最高（40 s^-1），而GSdGBd3R和DCP活性骤降至15%。ΔNGBd活性降低50%，表明N端GBd参与域间协同。
葡聚糖结合：ITC显示结合亲和力随GBd长度增加而增强，GSdGBd6R的K_d达1.21×10^-7 M，但DCP虽保留高亲和力（K_d=1.18×10^-7 M），活性却显著下降，提示单纯结合不足以驱动高效催化。
结构分析：CD谱显示GSdGBd6R和GSdGBd4RL呈现典型α-螺旋特征（208/222 nm双负峰），而DCP谱图类似GSd与GBd的简单叠加，暗示域间折叠独立性。热解折叠实验中，GSdGBd6R和GSdGBd4RL呈现单相转变（T_m=51.3°C和50.8°C），而GSdGBd3R和DCP显示双相转变，表明协同折叠受损。

讨论

研究首次提出GBd长度≥4个重复序列是维持高效葡糖基转移的关键阈值。N端GBd通过稳定U型折叠构象（含域V）介导GSd与GBd的变构耦合，而环形置换破坏域间取向，导致活性丧失。该发现为针对GBd设计抗龋药物（如抑制生物膜形成）提供了理论依据。

创新点

1. 揭示GBd长度与酶活性的非线性关系，明确四重复序列为功能临界点；
2. 通过DCP实验证明域间几何排列对催化效率的调控作用；
3. 提出“协同折叠-变构激活”模型，解释GTF-I的高效底物转移机制。

（注：以上内容严格基于原文数据，未添加主观推断。）