Cdx2转录调控在啮齿类动物中的进化分析揭示物种特异性结合与功能保守性

本研究通过多组学分析揭示了小鼠Cdx2转录因子DNA结合域(DBD)的三个特异性氨基酸变化并未影响其功能保守性，利用大鼠-小鼠异源二倍体胚胎干细胞(RMES)系统首次在生殖隔离物种间开展顺式调控(cis)研究，发现尽管Cdx2结合位点在小鼠和大鼠基因组间存在显著差异(仅23%保守)，但其诱导的转录效应却高度保守，为理解转录因子结合位点进化与功能可塑性提供了新视角。

　　

1 引言

基因表达的时空调控是表型多样性的重要驱动力，其差异主要源于顺式调控元件(cis-elements)的变异或转录因子(TFs)结合特性的改变。 caudal型同源框转录因子2(Cdx2)作为肠道特异性核转录因子，在维持肠上皮细胞分化和增殖中起关键作用。有趣的是，尽管转录因子DNA结合域(DBD)的进化速度通常远低于非编码调控元件，但研究者在小鼠Cdx2(mCdx2)的DBD中发现了三个啮齿类动物谱系特有的氨基酸变化，这为探索转录因子适应性进化提供了独特模型。

2 结果

2.1 mCdx2 DBD中的特异性氨基酸变化

通过系统比较1207个小鼠转录因子的DBD序列，发现Cdx2在人类和大鼠中完全保守，而小鼠DBD存在三个特异性突变（图1A）。系统发育分析表明这些变化发生在小鼠与大鼠分化后（约5-12.5百万年前），并在所有小鼠品系中固定，暗示可能受到正向选择。

2.2 Cdx2诱导滋养层样表观基因组重塑

通过建立多西环素(DOX)诱导的mCdx2过表达系统，观察到胚胎干细胞(mESC)形态向扁平上皮样细胞转变（图2B）。RNA-seq显示2603个基因差异表达，滋养层干细胞(TSC)标志物如Cdh2、Ascl2上调，而多能性标志物Oct4、Sox2下调（图2D）。ATAC-seq揭示39,369个染色质可及性差异区域，其中新开放区域(UP)富集Cdx/Hox家族结合 motif，而关闭区域(DOWN)富含Oct4/Sox motif（图2F）。

2.3 mCdx2与rCdx2功能保守性

比较大鼠Cdx2(rCdx2)过表达效果发现：转录组相关性达0.992（图3A），ChIP-seq结合谱相似性0.977（图3B），且两者在Hoxa基因家族的结合模式与调控效应完全一致（图3D）。de novo motif分析证实二者识别完全相同的DNA序列（图3E）。

2.4 小鼠特异性突变的功能验证

构建包含所有可能突变组合的7种rCdx2突变体（图4A），发现单个或组合突变均未影响细胞分化表型或转录调控功能（图4B），暗示这些变化可能是中性进化的结果。

2.5 物种特异性结合的顺式驱动机制

利用大鼠-小鼠异源二倍体胚胎干细胞(RMES)系统分析发现：仅23%的Cdx2结合位点在两物种间保守，57%因序列变异丧失结合（图5B）。保守位点具有更高的序列相似性和motif保留率（图5E-F），表明顺式变异是结合差异的主因。

2.6 结合差异与表达保守的解耦

7372个基因中，48.2%显示跨物种保守调控（类型4），这些基因富集于"发育与分化"通路且表达变化幅度最大（图6C-D）。值得注意的是，70%的保守调控基因并无保守结合位点，揭示转录调控网络的惊人可塑性。

3 讨论

这项研究首次系统分析了哺乳动物转录因子DBD的物种特异性适应。虽然mCdx2的三个氨基酸变化未在ESC系统中显现功能影响，但存在以下可能解释：①突变可能在中性进化过程中固定；②生理表达水平下或特定组织（如肠道）中才能显现表型；③需要其他协同因子的参与。RMES细胞系统的创新应用突破了生殖隔离限制，为研究物种间调控差异提供了新范式。

研究发现转录效应比结合位点具有更高保守性，这一现象可能源于：①远端调控元件的功能冗余；②辅因子结合的代偿作用；③非功能性结合的生物学噪音。该发现挑战了"结合位点保守必然导致功能保守"的传统认知，为理解基因调控网络的进化弹性提供了新视角。

4 结论

①建立首个哺乳动物跨物种TF结合差异分析框架；②揭示Cdx2介导的转录调控存在结合位点快速进化与功能保守并存的现象；③提供涵盖基因表达、染色质可及性和DNA结合的综合性资源；④开发RMES系统为后续研究提供技术平台。这些发现为理解表型进化的分子机制开辟了新途径。

5 方法

实验采用DOX诱导的Tet-On系统调控Cdx2表达，通过RNA-seq、ATAC-seq和ChIP-seq进行多组学分析。RMES细胞测序数据采用mm10和rn6双基因组比对策略，结合BLAT进行跨物种序列比对。差异基因/peak分析采用GFOLD（单重复）或DESeq2（多重复），motif分析使用HOMER，功能注释采用Ingenuity Pathway Analysis。所有测序数据均通过Illumina Xten平台产生，平均深度达30-100M reads。