细胞周期蛋白D1在多发性骨髓瘤发病机制中的非经典功能：超越细胞周期调控的细胞黏附与播散作用

这篇开创性研究揭示了细胞周期蛋白D1（cyclin D1）在多发性骨髓瘤（MM）中的非经典功能。通过转录组分析和多维流式细胞术，研究者发现cyclin D1过表达会上调STAT1、ZO-1等关键细胞黏附通路蛋白，导致肌动蛋白细胞骨架改变和基质黏附能力下降。临床队列验证显示73%高表达cyclin D1患者CD56阴性，且循环肿瘤细胞（CTCs）显著增加（P<0.001），为MM的侵袭机制提供了新见解。

　　

Abstract

细胞周期蛋白D（cyclins D）可能是多发性骨髓瘤（MM）发病的共同事件，尽管MM通常不被视为增殖性疾病。研究发现，在缺乏这些蛋白的MM细胞系中过表达CCND1和CCND2呈现互斥表达模式，两种cyclins D均定位于细胞质且不影响增殖。转录组分析和多维流式细胞术显示，cyclin D1过表达导致多个关键细胞黏附通路蛋白（包括STAT1和ZO-1）上调，伴随肌动蛋白细胞骨架改变和特定基质黏附能力下降。免疫表型分析显示cyclin D1过表达后CD56表达显著降低，在85例MM患者队列中得到验证——73%高cyclin D1患者为CD56阴性。高cyclin D1还与循环肿瘤细胞（CTCs）增加显著相关（P<0.001）。

Abbreviations

关键缩写包括：BM（骨髓）、CTC（循环肿瘤细胞）、FBS（胎牛血清）、MM（多发性骨髓瘤）、PC（浆细胞）等。实验技术涉及CNIA（毛细管电泳纳米免疫分析）、MTT（细胞增殖检测）和EdU（细胞周期分析）等。

1 Introduction

MM占所有癌症的2%和血液系统恶性肿瘤的10%，以恶性浆细胞（PCs）在骨髓（BM）中异常积聚为特征。尽管MM在DNA水平具有高度异质性，但几乎所有病例都过表达CCND1、CCND2或CCND3 mRNA。cyclins D的经典功能是调控G1/S期转换，但MM肿瘤细胞增殖指数低，提示cyclins D可能具有超越细胞周期调控的功能。

2 Materials and methods

研究使用9种MM细胞系和GEM2012临床试验的新诊断MM样本。通过慢病毒载体实现CCND1和CCND2过表达，采用CNIA技术检测蛋白表达，qRT-PCR分析基因表达，MTT和EdU检测增殖，转录组芯片分析基因表达谱，Transwell实验评估迁移能力，免疫荧光观察细胞形态，新一代流式细胞术分析免疫表型。

3 Results

3.1 MM细胞系中cyclin D蛋白的表达水平和亚细胞定位

大多数MM细胞系呈现cyclin D1或D2的互斥表达模式。U266细胞系共表达两种cyclin D但以cyclin D1为主，KMS-28BM和KMS-28PE不表达任何cyclin D。所有细胞系中cyclin D主要定位于细胞质。

3.2 MM细胞系中cyclin D1或D2过表达的影响

过表达一种cyclin D会导致另一种cyclin D内源性蛋白水平降低（AMO-1和JJN3除外），但不影响mRNA水平。与经典认知不同，cyclin D过表达未增加MM细胞系的增殖率。

3.3 基因表达谱分析

KMS-28BM_D1^OE与亲本细胞比较发现115个差异表达基因，细胞黏附分子结合通路显著富集。KMS-28PE_D1^OE显示86个差异基因，涉及抗原呈递和囊泡运输通路。

3.4 细胞黏附相关基因验证

FLNA、ICAM1、TJP1等基因在KMS-28BM_D1^OE中上调。临床样本验证显示，高cyclin D1患者STAT1和ZO-1蛋白水平显著升高。免疫荧光显示t(11;14)患者ZO-1形成明显聚集体。

3.5 cyclin D1过表达改变细胞形态和黏附能力

KMS-28BM_D1^OE和OPM2_D1^OE在PLL包被表面呈现更圆缩的形态和更小的铺展面积。两种细胞系对Geltrex和纤连蛋白的黏附能力显著降低，但迁移能力无显著变化。

3.6 cyclin D1过表达引起免疫表型改变

KMS-28BM_D1^OE中CD38表达增强而CD56表达消失。临床队列显示73%高cyclin D1患者CD56阴性（无cyclin D表达组仅17%）。高cyclin D1患者CTC数量显著增加（P<0.001）。

4 Discussion

研究首次证实cyclin D1过表达通过上调STAT1和ZO-1等黏附相关蛋白，改变肌动蛋白细胞骨架，导致MM细胞黏附能力下降和CD56表达缺失。这可能是t(11;14)MM患者易发生浆细胞白血病的基础。cyclin D1的胞质定位提示其非经典功能的重要性，为靶向治疗提供新思路。

5 Conclusions

研究揭示了cyclin D1在MM中超越细胞周期调控的新功能，特别是在细胞黏附和播散中的作用。这些发现深化了对MM生物学特性的认识，为开发针对cyclin D1介导通路的新型治疗策略奠定基础。

Acknowledgements

感谢Rut García和Esther González的技术支持，以及Philip Mason的英文润色。研究由Instituto de Salud Carlos III、AECC和Junta de Castilla y León资助。

Conflict of interest

部分作者声明与BMS、GSK等药企的利益关系，但与本研究无关。

Author contributions

IJC-B完成主要实验和初稿撰写；SC-V协助qRT-PCR；CDR提供临床数据；EAR参与CNIA实验；NCG和MC设计研究并指导全程；M-VM提供样本和临床数据。所有作者审阅并认可最终稿件。