超声介导的工程化骨髓间充质干细胞通过细胞内空化增强骨缺损修复的基因治疗策略

这篇研究创新性地开发了基于超声介导的工程化骨髓间充质干细胞（BMSCs）基因治疗技术。通过将核定位信号（NLS）、聚乙烯亚胺（PEI）和骨形态发生蛋白2质粒（pBMP2）加载到从嗜盐杆菌提取的气囊（GVs）中，构建了具有溶酶体逃逸和核靶向能力的BPNVs@BMSCs。低强度脉冲超声（LIPUS）诱导的细胞内空化显著提升核膜通透性，使质粒核转位效率和基因转染效率分别提高284.7%和131.6%，并持续表达BMP2蛋白21天，有效促进骨缺损修复。该技术为干细胞基因治疗提供了更安全高效的解决方案。

　　

工程化BMSCs的构建与表征

研究团队从嗜盐杆菌NRC-1中提取气囊（GVs），通过修饰核定位信号（NLS）和聚乙烯亚胺（PEI）构建了PEI/NLS-GVs复合物（PNVs），进一步加载骨形态发生蛋白2质粒（pBMP2）形成BPNVs。透射电镜显示BPNVs呈纺锤形，粒径约265.3±28.3 nm。该复合物可被BMSCs高效内化，48小时细胞活性仍保持90%以上，且不影响干细胞的炎症趋化能力。

溶酶体逃逸机制

BPNVs展现出卓越的酸缓冲能力，在pH 4.0条件下仍保持稳定的超声回声信号。共聚焦显微镜观察显示，BPNVs@BMSCs组的pBMP2与溶酶体共定位系数仅0.15±0.08，显著低于未修饰组（0.8±0.02）。透射电镜捕捉到BPNVs通过形成膜孔逃逸溶酶体的动态过程，这归功于PEI的"质子海绵效应"和NLS的DNA保护作用。

细胞内空化增强核转位

NLS引导BPNVs富集于核膜周围，使pBMP2与核膜距离缩短至170-290 nm。低强度脉冲超声（LIPUS）诱导的细胞内空化在核膜形成可逆性孔道（最大直径290 nm），粗糙内质网显著扩张提示蛋白合成活跃。定量分析显示，靶向细胞内空化组的核转位效率达284.7%，较传统超声靶向微泡破坏（UTMD）技术提升显著。

基因表达与成骨分化

流式细胞术检测显示BPNVs@BMSCs+LIPUS组的转染效率达60.9±8.2%，较非靶向组提高31.5%。qPCR证实BMP2 mRNA表达量提升117.5%，蛋白分泌可持续21天。碱性磷酸酶和茜素红染色显示，该组矿化结节形成早且量多，表明成骨分化能力显著增强。

骨缺损修复效果

大鼠股骨缺损模型显示，BPNVs@BMSCs+LIPUS组治疗4周后，微CT参数（BV/TV、BMD等）显著改善，缺损区完全被新生骨组织填充。组织学分析可见成熟骨小梁结构，免疫组化显示BMP2、CD34和ALP等成骨相关蛋白高表达，且主要脏器未见病理改变，证实该技术的安全性和有效性。

这项研究通过整合生物工程与物理刺激策略，突破了传统基因治疗的效率瓶颈，为临床骨再生医学提供了创新性解决方案。