PagMIR166c-PagECH2模块通过不同生长素信号通路调控杨树茎次生木质部分化、细胞扩张及木质素沉积的分子机制

本研究首次揭示了PagMIR166c通过靶向生长素生物合成关键基因PagECH2，调控杨树茎次生木质部形成的分子机制。研究发现，PagMIR166c过表达抑制形成层向次生木质部的分化和细胞扩张，但促进木质素沉积和细胞壁增厚；CRISPR/Cas9介导的pagmir166c突变体则呈现相反表型。通过5'RLM-RACE、降解组测序和双荧光素酶报告系统证实PagMIR166c直接靶向PagECH2，并发现该模块通过不同ARFs（PagARF2/3/4/5/7）介导的生长素信号通路调控次生木质部形成的关键发育阶段，为林木分子育种提供了新靶点。

　　

【研究背景】

次生木质部作为树木生物量的主要来源，其形成过程受到microRNAs（miRNAs）的重要调控。杨树MIR166基因家族包含17个成员，其中PagMIR166c在次生茎中表达量显著高于其他成员。前期研究发现Gynostemma pentaphyllum中GpMIR166b可能通过靶向GpECH2调控初生木质部细胞扩张，而PagMIR166c是其同源基因，这引发了关于该基因在次生木质部形成中作用的科学疑问。

【PagMIR166c的功能验证】

通过构建35S::PagMIR166c过表达株系和CRISPR/Cas9介导的pagmir166c突变体，研究发现：

1. PagMIR166c过表达植株表现为生长迟缓，株高降低49.9%，茎粗减少20.5%，次生木质部细胞层数和宽度显著减少，导管和纤维细胞尺寸缩小；而突变体则呈现相反表型。

2. 在细胞壁特性方面，过表达植株的次生木质部细胞壁增厚，木质素含量增加，S/G型木质素比例升高；突变体则表现为细胞壁变薄，木质素含量降低。

3. 分子标记分析显示，过表达植株中形成层发育标记基因（PagWOX4a/b、PagPXYa等）和木质部发育标记基因（PagWND6A/B等）表达下调，而突变体中这些基因表达上调。

【分子机制解析】

1. 靶基因验证：通过双荧光素酶报告系统、5'RLM-RACE和降解组测序证实PagMIR166c在638bp处切割PagECH2 mRNA。PagECH2编码参与IBA向IAA转化的关键酶，其过表达植株表型与pagmir166c突变体相似。

2. 信号通路分析：PagMIR166c-PagECH2模块通过不同ARFs介导生长素信号通路：

   • PagARF2负调控木质素沉积：其表达下调导致木质素沉积增加

   • PagARF3/4/5/7正调控形成层活性和细胞扩张：这些基因表达变化与次生木质部细胞层数和大小直接相关

3. 协同调控模型：该模块通过动态平衡调控次生木质部发育的两个关键阶段——细胞扩张阶段（抑制）和木质素沉积阶段（促进）。

【研究意义】

该研究首次报道了树木中PagMIR166c-PagECH2模块通过多层级生长素信号网络调控次生木质部形成的分子机制。特别值得注意的是：

1. 揭示了MIR166家族成员通过靶向非HD-ZIP III基因的新功能

2. 阐明了次生木质部细胞扩张与木质素沉积的协同调控机制

3. 发现的PagARF2/3/4/5/7介导的信号通路为林木分子设计育种提供了多个潜在靶点

研究结果对提高林木生物量、改良木材品质具有重要应用价值，为"双碳"背景下的森林碳汇能力提升提供了理论支撑。该发现还可拓展应用于其他木本植物的遗传改良，推动木质纤维素生物质能源的开发。