番茄致病性密歇根棍状杆菌菌株比较基因组分析揭示毒力基因的遗传多样性

这篇研究通过高通量测序(NovaSeq 6000)对12株具有不同致病性的番茄致病性密歇根棍状杆菌(Cmm)进行全基因组比较分析，揭示了毒力相关基因(包括丝氨酸蛋白酶、纤维素酶celA/celB、木聚糖酶xysA/xysB、果胶酶pelA1/pelA2和番茄碱酶tomA)的高度保守性，同时发现73个独特基因簇可能与菌株间致病性差异(DSI 18%-85%)相关，为解析该病原菌的致病机制提供了重要基因组学依据。

　　

摘要

革兰氏阳性菌密歇根棍状杆菌亚种(Cmm)引起的细菌性溃疡病是番茄(Solanum lycopersicum)等作物的毁灭性病害。研究团队通过对12株具有不同致病性的Cmm菌株及参考菌株PD223进行全基因组测序和比较分析，揭示了毒力相关基因的遗传多样性特征。

1 引言

Cmm自1909年在密歇根首次发现以来，已在全球主要番茄产区造成50%-80%的产量损失。该病原菌通过种子传播，通过伤口或毛状体侵入植物后，在木质部导管中增殖，导致叶片萎蔫、茎溃疡等症状。与革兰氏阴性菌不同，Cmm缺乏III型分泌系统(T3SS)，其致病性主要依赖分泌的细胞壁降解酶(CWDEs)和效应蛋白。

2 材料与方法

2.1 菌株培养与DNA提取

13株Cmm菌株(包括12个测试株和参考株PD223)在LB培养基中培养后，使用Supure Bacterial DNA Isolation Kit提取基因组DNA，经Qubit 3.0和Agilent 5400 Fragment Analyzer进行质控。

2.2 致病性测试

使用敏感番茄品种"Torry"进行接种实验，注射10⁸ CFU/mL菌悬液，3周后计算疾病严重指数(DSI)。

2.3 全基因组测序

采用Illumina NovaSeq 6000平台进行2×150 bp双端测序，平均获得7.46 Gbp数据量，覆盖深度达2200×。

2.4 基因组组装与注释

使用BWA比对至参考基因组(Gcf_009739655.1)，CLC Genomics Workbench进行功能注释。

2.5 比较基因组分析

通过PyParanoid v0.4进行直系同源群分析，鉴定保守和特有基因家族。

3 结果与讨论

3.1 菌株致病性

致病性测试显示Cmm2、Cmm3、Cmm8和Cmm13的DSI最高(75%-85%)，而Cmm4、Cmm9和Cmm12的DSI最低(~20%)。

3.2 基因组特征

测序获得的高质量基因组中，GC含量为71.9%-72.37%，与已知Cmm菌株一致。最长的contig达2,085,300 bp，远超过参考株的246,542 bp。

3.3 直系同源群分析

在3426个直系同源群中，2847个(83%)在所有Cmm菌株中保守，73个仅在三株菌中共享，提示基因获得事件导致的遗传分化。

3.4 毒力相关蛋白分析

所有菌株均编码关键毒力因子：

• 木聚糖酶：XysA、XysB和Tcxys高度保守(98.56%-100%相似度)，但Cmm6存在xysA基因复制

• 果胶酶：PelA1和PelA2形成两个独立进化枝，存在I205M和A268P等氨基酸替换

• 纤维素酶：质粒编码的CelA和染色体CelB均保守，但Cmm4的CelA有19个氨基酸缺失

• 丝氨酸蛋白酶：7-9个成员，包括pat-1、chpC等，分为9个功能亚群

• 番茄碱酶：TomA高度保守(98.34%-100%)，但存在H198R等可能影响酶活的突变

值得注意的是，虽然这些毒力基因高度保守，但其表达调控或其他未鉴定的毒力因子可能是导致菌株间致病性差异的关键。

4 结论

该研究揭示了Cmm毒力基因的遗传多样性特征，为理解其致病机制提供了重要线索。未来研究应聚焦于毒力基因的表达调控和功能验证，以全面解析Cmm的致病机理。