周期基因(Cycle)调控北方家蚊(Culex pipiens)昼夜节律与季节性繁殖的分子机制研究

本研究针对北方家蚊(Culex pipiens)的季节性滞育调控机制，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建cycle(cyc)基因敲除突变体(CpCyc-/-)，揭示了该核心生物钟转录因子在调控昼夜活动节律和季节性繁殖中的双重作用。研究发现cyc缺失导致79%突变体丧失恒定黑暗条件下的节律性活动，并显著降低timeless(tim)和vrille(vri)等核心生物钟基因的表达；更重要的是，突变体在夏季长日照条件下仍表现出70%的生殖滞育率，证实cyc是连接光周期感知与滞育调控的关键分子开关。该成果为蚊媒季节性适应机制研究提供了新见解，对虫媒疾病防控具有重要启示。

　　

在温带地区，蚊虫通过精确感知昼夜光周期变化来协调季节性繁殖与越冬策略，这种神奇的生物钟机制困扰了科学家近一个世纪。作为西尼罗病毒主要传播媒介的北方家蚊(Culex pipiens)，其雌性成虫会进入以生殖停滞为特征的滞育(diapause)状态越冬，这种状态由短日照触发、通过抑制保幼激素(JH)信号通路实现。虽然已知生物钟基因与光周期测量存在关联，但具体分子机制始终成谜——究竟是整个生物钟系统还是特定基因负责"测量"日长？这个基础科学问题对理解虫媒季节性适应和疾病传播规律具有重要意义。

美国俄亥俄州立大学(The Ohio State University)昆虫学系Matthew Wolkoff领衔的研究团队，通过创新性地构建cycle基因突变体，首次在分子水平解析了核心生物钟转录因子CYCLE(CYC)在北方家蚊昼夜节律和季节性繁殖中的双重调控作用。这项突破性研究成果发表在《Scientific Reports》期刊，为昆虫生物钟与光周期响应机制研究树立了新标杆。

研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向cyc基因第7外显子构建8-bp缺失突变体，通过比较野生型与突变体在长日照(LD)和短日照(SD)条件下的表型差异。关键技术包括：1)基于FlyBox系统的昼夜活动监测；2)卵泡长度测量评估滞育状态；3)qRT-PCR分析核心生物钟基因(cyc、Clk、per、tim等)和滞育相关基因(FOXO、allatotropin等)的转录动态；4)使用CircaCompare软件进行节律分析。所有实验均设置严格的光周期控制(16:8h LD和8:16h SD)和温度条件(18℃)。

研究结果部分包含以下重要发现：

CpCyc-/-突变体表现出光周期不敏感的滞育表型
通过卵泡长度测量发现，野生型在LD条件下80%个体避免滞育(卵泡>75μm)，而SD条件下100%进入滞育。突变体则表现出显著差异：无论LD(76%)还是SD(70%)条件下，多数CpCyc-/-个体都保持滞育状态，且FOXO转录水平在LD条件下显著升高。这表明cyc缺失使蚊子"无视"光周期信号而持续维持滞育状态。

昼夜节律行为严重受损
在恒定黑暗(D:D)条件下，79%突变体丧失活动节律性，而野生型保持96%节律性。有趣的是，在光暗(L:D)条件下所有基因型都维持正常节律，提示CYC对内源性节律生成至关重要，但不影响外源光信号响应。突变体在D:D中还表现出异常增高的活动水平。

核心生物钟基因表达紊乱
转录分析显示突变体中tim和vri表达量骤降，per、Clk等基因振荡幅度显著减弱。特别值得注意的是，tim在突变体中的表达量仅为野生型的0.7%，证实CYC是tim表达的主要调控者。Pdp1和cry2虽然保持节律性，但相位和振幅均发生改变。

这项研究首次证实cycle基因在蚊虫中具有"双重身份"：既是核心生物钟组件，又是季节性繁殖的直接调控者。从机制上看，CYC可能通过双重途径发挥作用：1)作为生物钟转录因子维持tim等基因的节律表达；2)独立于生物钟直接调控allatotropin等生殖相关基因。这种"一因多效"的特性解释了为何cyc缺失会同时影响昼夜节律和滞育诱导。

该研究的科学价值主要体现在三个方面：首先，解决了关于生物钟基因是否直接参与光周期测量的长期争议，证明特定基因(如cyc)而非整个生物钟系统起关键作用；其次，为理解昆虫季节性适应的分子基础提供了新范式，突变体在夏季条件下仍保持滞育的特征具有重要生态学意义；最后，从应用角度看，针对cyc的调控可能成为蚊媒防控新策略——通过人工诱导滞育状态来抑制种群增长和病毒传播。正如作者指出，这项发现为开发"通过扰乱生物钟基因来抑制蚊媒繁殖"的靶向干预措施奠定了理论基础。

未来研究需要进一步解析CYC下游的具体效应分子，特别是其如何协调生物钟功能与代谢调控网络。此外，突变体在L:D条件下保持节律的机制也值得深入探讨，这可能涉及其他光感受通路(如视蛋白)的代偿作用。总之，这项工作开辟了昆虫生物钟与季节性适应研究的新方向，其方法论和理论框架对理解其他物种的光周期响应机制具有广泛借鉴意义。