基于多重探针扩增熔解曲线分析技术同步检测九种潜在生物恐怖主义病毒的高灵敏度方法

这篇研究开发了一种创新的多重探针扩增（MPA）结合熔解曲线分析技术，可在单次反应中同时检测埃博拉病毒（EBOV）、拉沙病毒（LASV）等九种高致病性病毒。该方法通过三荧光通道和独特熔解温度（Tm）实现靶标区分，灵敏度达1.5-15拷贝/μL，在392份模拟样本和22例临床样本中验证准确率达100%，为生物恐怖防御和疫情监控提供了高效、低成本的高通量解决方案。

　　

ABSTRACT
本研究针对埃博拉病毒（EBOV）、拉沙病毒（LASV）等九种可能用于生物恐怖的高危病毒，开发了基于多重探针扩增（MPA）技术的单管同步检测方案。通过设计特异性靶标杂交寡核苷酸（THO）和部分互补探针（PCO），利用三荧光通道（FAM/HEX/ROX）与差异熔解温度（35-55°C）的二维锁定关系，实现单反应检测10个靶标（含内参基因）。

INTRODUCTION
九种病毒可引发出血热、脑炎等严重疾病，被欧美列为最高生物安全威胁。传统qPCR受限于荧光通道数量，而微流控技术难以大规模筛查。MPA技术通过THO/PCO杂交体的特异性T_m值突破通道限制，此前已应用于真菌和肠道病毒检测，但高危病毒领域尚属空白。

MATERIALS AND METHODS

• 靶标设计：从GenBank获取九种病毒保守序列，经MegAlign比对筛选。
• 探针优化：THO探针5′端标记荧光基团，3′端淬灭基团；PCO通过碱基错配设计特定T_m，形成温度-荧光双维度识别。
• 病毒样颗粒（VLP）：将靶基因插入pE380-MS2质粒，经IPTG诱导后通过透射电镜（TEM）验证30 nm颗粒形态，ddPCR定量达10⁷-10⁸拷贝/μL。
• 灵敏度验证：系列稀释VLP核酸显示，裂谷热病毒（RVFV）检测限低至1.5拷贝/μL，其余靶标为15拷贝/μL。

RESULTS

• 多重检测能力：在九病毒混合样本中，所有靶标均被准确识别，熔解峰降幅值Δ(?dF/dT)显著高于阈值。
• 模拟样本测试：392份血清、土壤等模拟样本（含双病毒混合）检出率100%，非靶标病毒（如登革病毒）无交叉反应。
• 临床验证：12例MPXV和蜱传脑炎病毒（TBEV）阳性样本的Ct值与传统qPCR相当，10例阴性样本未出现假阳性。

DISCUSSION
MPA-nine-viruses突破了传统qPCR的通道限制，较微流控技术更适用于大规模筛查。尽管临床样本获取受限，但VLP模拟和初步临床数据证实其可靠性。未来需通过FDA审批扩大验证范围，以应对生物恐怖和突发疫情。

结论
该技术为九种高危病原体提供了首个单管多重检测方案，兼具超敏（1.5拷贝/μL）、低成本（96孔板兼容）和抗干扰特性，在反生物恐怖和公共卫生应急中具有重大应用潜力。