木霉侵略者基因组编辑工具箱的构建及其在次级代谢与菌寄生生物学研究中的应用

本研究为木霉侵略者（Trichoderma aggressivum）开发了高效的基因组编辑工具包，通过建立质粒转化和CRISPR-Cas9-RNP基因编辑体系，验证了hph和pyr4基因作为选择标记的适用性，为解析其菌寄生机制（mycoparasitism）与次级代谢产物的生物合成通路（BGCs）提供了关键技术支撑。

　　

木霉侵略者的基因组操作工具箱开发

ABSTRACT

木霉属真菌作为食用菌栽培中的常见污染源，其代表种木霉侵略者（Trichoderma aggressivum）是双孢蘑菇（Agaricus bisporus）绿霉病的主要病原体。有趣的是，该菌同时具备生物防治和植物促生潜力，这些特性与其次级代谢产物密切相关。研究团队建立了包含质粒转化和CRISPR-Cas9-RNP基因编辑的完整操作体系，通过hph潮霉素抗性基因和来自里氏木霉（T. reesei）的pyr4基因验证了选择标记的适用性，为深入解析其生物学功能提供了关键工具。

INTRODUCTION

在食用菌栽培领域，木霉侵略者引发的绿霉病造成严重经济损失。该菌的菌寄生特性涉及复杂次级代谢调控，但其分子机制尚未阐明。传统转化方法如PEG介导的原生质体转化和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化各有局限，而CRISPR-Cas9系统通过RNP复合体递送可提高编辑效率并减少脱靶效应。本研究聚焦两个关键问题：建立高效转化体系，开发适用于木霉侵略者的基因编辑策略。

MATERIALS AND METHODS

原生质体制备

采用Vinotaste Pro与蛋白酶K混合酶解体系处理菌丝体，经3小时37°C消化后获得原生质体（密度约3.8×10⁵个/mL），显微镜下可见典型圆形细胞形态。

质粒转化

使用pAN7-1质粒（含hph基因）进行PEG介导转化，转化效率达26.63 cfu/μg DNA。计算公式：t_eff = 菌落数/（μg DNA×原生质体数）。

CRISPR-Cas9-RNP编辑

针对pyr4基因设计双sgRNA靶点，通过NEB EnGen系统合成向导RNA。将预组装的Cas9-sgRNA复合体与原生质体共转化，在含5-FOA的MA培养基上筛选尿苷营养缺陷型突变株。

遗传验证

采用CTAB法提取基因组DNA，通过特异性引物扩增靶标位点并进行测序分析。表型验证包括MA基础培养基、MA+尿苷、MA+尿苷+5-FOA三组培养实验。

RESULTS AND DISCUSSION

hph标记的转化验证

三组独立转化实验显示，质粒剂量与菌落数呈正相关（2.5μg→79CFUs，10μg→197CFUs），平均效率达26.63 cfu/μg，证实hph可作为有效选择标记。

pyr4基因编辑多样性

四株阳性突变体表现出不同的基因编辑模式：1号候选株出现部分缺失+3'端额外缺失；2号株在靶位点插入220bp线粒体DNA；3号株被无关基因组区域替换；仅4号株获得预期精确缺失。这种多样性反映了真菌非同源末端连接（NHEJ）修复途径的复杂性。

跨物种pyr4互补实验

将里氏木霉pyr4基因导入突变体后，转化效率达25.4 cfu/μg。但表型分析显示，回补菌株在MA培养基上生长弱于野生型，提示跨物种基因存在功能差异。值得注意的是，该体系可实现正向选择——转化子能在无尿苷培养基中生长，而亲本Δpyr4菌株完全不能生长。

应用前景

该工具箱的建立为以下研究铺平道路：1）通过激活沉默的生物合成基因簇（BGCs）发掘新型次级代谢产物；2）解析木霉侵略者与双孢蘑菇互作的分子机制；3）开发基于基因编辑的菌株改良策略。特别是CRISPR-RNP体系的高效性，为研究丝状真菌的基因功能提供了新范式。

技术亮点

1. 首创木霉侵略者原生质体制备标准流程

2. 实现CRISPR-RNP在木霉属的直接应用

3. 建立双选择标记（hph/pyr4）交叉验证体系

4. 发现线粒体DNA异常插入的基因编辑新现象

该研究不仅解决了特定物种的遗传操作难题，其技术路线对其它难转化丝状真菌也具有重要参考价值。未来可结合质谱分析等技术，系统揭示次级代谢产物的生物合成网络。